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2019-nCoV (新型冠狀病毒)似乎像一場沒有被預測到的暴風雨，迅速席卷了中國甚至全球。面對這場突如其來的疫情，人們雖然有惶恐，但是卻沒有亂了陣腳，逆行者比比皆是。

病毒這種古老的生物，在人類的發展史上，從來都沒有缺席。迄今為止，除了2019-nCoV新冠狀病毒外，還發現6種可以感染人類的冠狀病毒，其中中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）和嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV）以及2019-nCoV可引起嚴重癥狀，致死率較高。針對這一類冠狀病毒還沒特效藥物，因此疫苗的開發顯得尤為重要。隨著分子生物學的不斷進步，疫苗的種類也越發豐富，從傳統滅活/減毒疫苗，發展到重組疫苗，病毒載體疫苗，以及核酸疫苗。新冠病毒疫苗的研發也是采取了多路并行的方式。

滅活病毒疫苗通常是指全病毒滅活疫苗，由于其含有完整病毒幾乎全部的抗原成份，具有較強的免疫原性，是最具有成功潛能的疫苗路線之一。現代工藝中滅活疫苗的基本工藝路線可參考如下：


▲圖1 滅活疫苗整體工藝路線

這條工藝路線涉及了從培養基準備開始直至終端制劑灌裝的全流程，頗爾在該流程中各工藝點都可以提供相應的解決方案。本文僅概要介紹下游工藝中收獲澄清、層析純化、TFF濃縮及緩沖置換、除菌過濾等幾個工藝點。

收獲澄清

滅活病毒疫苗的生產多使用雞胚或者貼壁依賴型細胞來繁殖病毒。無論哪種培養方式，下游工藝首先需要考慮如何有效獲取培養上清液。何為有效？抗原回收率，濾出液澄清度以及處理量都是關鍵性能指標。針對雞胚尿囊液或是貼壁培養細胞這類污染物水平相對不高的料液來說，頗爾可以提供多種直流過濾器，采用簡單的直流過濾操作模式來完成，快速且便捷。

對于高污染物水平的病毒收獲液可以選擇深層過濾產品，深層過濾具有更高的容污能力。傳統深層過濾產品，由于存在硅藻土和珍珠巖等助濾劑成分，對病毒類料液可能會產生吸附從而影響產品回收率。頗爾可以提供PDK11，V100P以及Bio系列的深層過濾器解決這一問題。圖2比較了頗爾公司HDC II聚丙烯過濾器與V100P深層過濾器在流感疫苗病毒收獲液中的表現， V100P回收率高于90%，處理量達到200L/m2。


▲圖 2 V100P深層過濾器澄清效果

層析純化

對于較大生物分子（如病毒，病毒載體，VLPs或質粒）的層析純化，難點在于傳統的層析介質孔徑小，較大的生物分子難以充分接觸到介質孔隙中的配基，一方面載量受限，另一方面很難有效洗脫。對此可應用頗爾的Mustang Q陰離子膜層析，其基質為0.8µm孔徑的PES膜材，生物大分子可以輕松進入膜孔與配基結合（如圖3），同樣也容易被洗脫，保證高載量的同時可以獲得較高的回收率。得益于其設計原理，Mustang Q可以耐受高達10MV/min的流速，也就是說5ml的膜層析裝置即可達到50ml/min的流速，采用小體積膜在短時間內可以處理大量料液，有效提高工藝效益，降低成本。


▲圖3 膜層析與傳統層析原理對比

TFF濃縮及緩沖液置換

切向流過濾技術在疫苗下游工藝中被廣泛應用，頗爾的T系列膜包具有高濾速、低蛋白吸附等特點，并且符合GMP要求，有完善的驗證文件，保證產品符合最新法規的要求。針對剪切力敏感的病毒類產品，也可以選擇單程切向流技術即SPTFF (Single-Pass Tangential Flow Filtration)。SPTFF用單向的長流路替代了傳統的循環流路，顯著降低了剪切力，提高了產品收率。另一方面，SPTFF的多級設計還可以滿足高濃縮倍數的需求，也可以適應連續生產的需求。

▲圖4. 切向流系列產品

除菌過濾

除了個別尺寸較大的病毒（如狂犬疫苗）無法實現外，對于大多數疫苗產品來說終端除菌過濾都是不可或缺的工藝。PES材質的除菌級過濾器，得益于它吸附低，速度快等優勢，被廣泛應用于此工藝點。而針對相對顆粒較大的病毒來說，回收率是重點關注對象，Supor® EKV以及 Supor® EX ECV ，其優異的制膜工藝顯著提升膜材的容污能力，配合巧妙的打褶方式和特殊小內核設計，可以增加過濾器處理能力，順利解決工藝難題。


▲ 圖5 除菌過濾器設計特征
（A對稱孔；B非對稱孔；C普通打褶；
D超級打褶；E普通內核；F小內核）


結語

疫苗研發工作的最終目標都是走向臨床，進入生產，并最終應用保護人類安全。開發者需要研發出安全、有效、可供的藥品，尤其是疫苗這種需要被廣泛應用的產品，需要在研發之初就充分考慮要做出人人用得起的藥物。頗爾作為生物技術解決方案的供應商，所提供的方案均有成熟的放大產品和使用經驗，可以支持藥物的順利放大生產，良好的性能有利于降低生產成本。

參考資料
1.Epidemiology, Genetic Recombination, and Pathogenesis of Coronaviruses
2.A Scalable Lentiviral Vector Production and Purification Method Using Mustang Q Chromatography and Tangential Flow Filtration
3.Improved Virus Purification Processes for Vaccines and Gene Therapy
4.Protein concentration with single-pass tangential flow filtration (SPTFF)
5.Clarification of influenza virus harvest with Seitz® depth filter sheet V100P: A compact and economical solution for maximal virus yield and robust protection of downstream purification steps(USD2971)
6.Purification of Influenza Virus by Ion Exchange Chromatography on Mustang® Q XT Membranes(USD2916)