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檢測試劑的生產(chǎn)質(zhì)控與診斷試劑的評價既有相同點，因為都是基于相同的評價指標(biāo)；又有不同點，生產(chǎn)過程會關(guān)注原料、半成品、成品，診斷試劑評價只針對成品。

本章的很多內(nèi)容基于《核酸檢測試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》，但是這個原則缺乏可操作性，因此又進(jìn)行了擴(kuò)展和延伸，供大家參考。

01

原材料

1.dNTP

脫氧三磷酸核苷，核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。

應(yīng)為HPLC純、PCR級，無DNase和RNase污染。-20℃保存。

2.引物

由一定數(shù)量的核苷酸構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，1800D以上。序列正確。純度應(yīng)達(dá)到電泳級（PAGE）或HPLC級，不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

應(yīng)作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm的比值在1.6~2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5-端標(biāo)記熒光素報告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在3-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，90D以上。純度應(yīng)達(dá)到HPLC純，不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜；應(yīng)對探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實，并作HPLC分析。應(yīng)以可見—紫外分光光度計進(jìn)行200~800nm掃描，在260nm處應(yīng)有吸收峰。另外，根據(jù)標(biāo)記的熒光素的不同，還應(yīng)該在熒光素的激發(fā)波長處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫。避光、-20℃保存。

4.Taq DNA聚合酶

具有DNA聚合酶活性，無核酸外切酶活性及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.UNG（尿嘧啶糖基化酶）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，IU UNG在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模版應(yīng)完全降解，不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。-20℃保存。

6.RT-PCR酶（反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增酶）

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性和DNA聚合酶活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃1小時后仍保持50%活性，-20℃保存。

02

半成品與成品的質(zhì)控

半成品與成品的質(zhì)控基本上基于相同的評價指標(biāo)，這里就合并在一起了。

1.精密度/重復(fù)性

指在同一實驗室使用相同方法進(jìn)行批內(nèi)與批間測量的一致性。

1.1 樣品：

至少三個水平

陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度

臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性

1.2 評價指標(biāo)：

檢出率：陰性樣品和中/強陽性樣本檢出率為100%，臨界陽性樣本陽性檢出率應(yīng)≥95%。

變異系數(shù)：通常使用變異系數(shù)（CV）來評價重復(fù)性，一般要求CV≤10%，qPCR檢測試劑Ct值的CV≤5% 。

1.3 批內(nèi)重復(fù)性：

同一批試劑，至少高/中,臨界和陰性3個水平的樣品，進(jìn)行3次以上重復(fù)。

1.4 批間重復(fù)性：

至少3批試劑，至少高/中,臨界和陰性3個水平的樣品，不同的時間，經(jīng)不同的操作者，進(jìn)行至少20次的測定。

2.靈敏度/分析敏感性/最低檢測限

這里有2個指標(biāo)需要評價一個是最低檢測限，一個是線性。

2.1 評價指標(biāo)：

使用相同基質(zhì)稀釋病原體、質(zhì)粒、假病毒等。

最低檢測限：qPCR低于樣品中1000 copies/mL或10 copies/reaction。

在《2020年新型冠狀病毒核酸檢測室間質(zhì)量評價結(jié)果報告》中樣品設(shè)置的濃度最低為640 copies/mL，各廠家檢測結(jié)果如下圖。而各試劑廠家標(biāo)識的最低檢測限分別為：

北京卓誠惠生(200)、華大生物(100)、上海伯杰(1000)、上海捷諾(500)、上海之江(1000)、圣湘生物(200)和中山達(dá)安(500)。

≤1000 copies/mL也是主流廠家普遍采用的最低檢測限，如果考慮到提取過程濃縮2-5倍和加模板量的2-5μL，換算為copies/reaction約為10。

3.線性：R2>0.98，擴(kuò)增效率(90%-110%)

2.2 評價指標(biāo)：

最低檢測限的評估應(yīng)該分2步進(jìn)行，首先選擇已知量值的模擬樣品（DNA病毒為質(zhì)粒或假病毒，RNA病毒為假病毒）或臨床樣品進(jìn)行倍比稀釋。

使用梯度稀釋法，每個濃度梯度最少重復(fù)3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限。

在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。

2.3 線性：

至少5個濃度，每個濃度至少3次重復(fù)。

3.分析特異性/交叉反應(yīng)

將樣品基質(zhì)中的目標(biāo)分析物與其他成分區(qū)分開的能力，如宿主DNA、血液組織等基質(zhì)。

3.1 非目標(biāo)微生物：

其他非目標(biāo)微生物或其他非目標(biāo)亞型微生物。

3.2 內(nèi)源性干擾物：

3.3 外源性干擾物：

3.4 常見干擾物建議試驗濃度：

根據(jù)自身情況自己選擇。

4.符合率

測試臨床樣品的診斷敏感性和診斷特異性。

5.穩(wěn)定性

應(yīng)對需要進(jìn)行穩(wěn)定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。穩(wěn)定性試驗可采用加速破壞試驗。

03

質(zhì)量控制樣品盤

上述的指標(biāo)可以通過制備一個樣品盤同時對多指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)控。如下圖▼

04

質(zhì)量控制圖

生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制最常用的工具就是質(zhì)量控制圖。目前最廣泛使用的質(zhì)量控制圖是Levey-Jennings chart結(jié)合Westgard rules質(zhì)控規(guī)則。

通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或者定值質(zhì)控品對每批次產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)控進(jìn)而繪制質(zhì)量控制圖可以更科學(xué)的評估每批次產(chǎn)品的質(zhì)量。

05

計量溯源性

在有國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下，診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)主動的將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)用到產(chǎn)品中，以保證診斷試劑可以溯源到準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品。

小結(jié)

實驗室自制的試劑由于缺乏嚴(yán)格的質(zhì)量控制，無法做到產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可靠，本人是不認(rèn)同的。核酸檢測試劑生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)屬于每個企業(yè)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，可以使用最低標(biāo)準(zhǔn)也可以使用更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。這取決于每個企業(yè)對產(chǎn)品質(zhì)量的要求。

我希望在中國的市場上大家追求的是“高質(zhì)高價”而不是“物美價廉”。