隨著2010版GMP的頒布和進一步實施，無菌藥品生產(chǎn)中“除菌過濾工藝”的風(fēng)險控制和驗證，成為制藥行業(yè)關(guān)注的熱點。標準驗證指南內(nèi)容（Validation Guide）對除菌過濾器驗證內(nèi)容做了詳盡描述，要求通過嚴格驗證確保濾芯的安全應(yīng)用和過濾性能的一致性和穩(wěn)定性。除菌過濾器驗證服務(wù)主要有6項，分為藥液對濾芯的影響：化學(xué)相容性試驗（ Compatibility testing）和完整性試驗（Product-wet integrity test）；濾芯對料液的影響：溶出物試驗 （Extractable testing）和吸附試驗（ Adsorption testing）；藥液對濾芯細菌截留率的影響：細菌存活試驗（ Bacterial viability testing ）和細菌截留試驗 （Bacterial challenge testing ）。本文將重點介紹細菌截留實驗部分。
除菌過濾工藝的意義
除菌過濾的目的是通過過濾去除原料藥液里的細菌。如果產(chǎn)品無法進行最終滅菌，需要采用0.22mm（更小或相同過濾效力）的除菌過濾器進行除菌過濾。新版GMP附錄1“第十三章，非最終滅菌產(chǎn)品的過濾”，第九十一條規(guī)定，與其他滅菌方法相比，除菌過濾的風(fēng)險最大，因此，宜安裝第二只已滅菌的除菌過濾器再過濾一次藥液。圖1為除菌過濾工藝的典型流程示意圖，澄清過濾一般采用深層濾芯，去除原料料液中的不純物質(zhì)，降低料液濁度和生物負荷度。無菌過濾點采用預(yù)過濾與除菌過濾組合的方式確保除菌效率和濾芯過濾性能的穩(wěn)定性。法規(guī)要求的第一個要點是在采用除菌過濾方法時，首先確認采用的過濾器為“除菌級”，達到此要求后，除菌過濾法中的其他無菌保障措施才有意義。定義過濾器是否為除菌級，需要依靠過濾器的微生物截留能力，并完成相關(guān)的標準方法驗證和工藝驗證。目前業(yè)界缺乏內(nèi)統(tǒng)一標準來衡量孔徑，孔徑的大小對預(yù)測微生物截留和比較不同生產(chǎn)商生產(chǎn)的過濾器沒有實際的意義，因而，需要用微生物截留能力來定義除菌級過濾器。從此可以看出細菌截留試驗對于除菌濾芯驗證的重要性。
細菌截留實驗
準備階段
新版GMP實施指南中提到除菌級過濾器的驗證需要考慮兩個主要因素：一是濾膜的級別，要求可適用的標準化試驗或類似的方法以細菌挑戰(zhàn)的方式進行；二是工藝驗證，由過濾器的使用者或指派的實驗設(shè)施（例如，過濾器的生產(chǎn)者或協(xié)議實驗室），使用有代表性的微生物進行挑戰(zhàn)，證明過濾器在生產(chǎn)條件下，可以完全去除每個產(chǎn)品或產(chǎn)品家族中的微生物。應(yīng)建立針對每個產(chǎn)品組的科學(xué)解釋，并可能需要在實施驗證前經(jīng)合適的監(jiān)管機構(gòu)審查。細菌截留實驗可以完全驗證過濾濾芯的細菌截留性能，也可以充分反映整個工藝環(huán)節(jié)對濾芯過濾性能的影響。因此，在截留試驗前必須做好如下準備：
過濾工藝評估：通過驗證服務(wù)調(diào)查問卷，客戶溝通甚至現(xiàn)場拜訪，需要完全了解客戶工藝流程，包括溶劑性質(zhì)（例如水基的、酸、堿、有機的）、過濾時間、工藝壓差、工藝流速、工藝溫度和過濾器設(shè)計規(guī)范，實驗室根據(jù)具體的情況，再結(jié)合過濾器本身的一些特性，模擬縮小化的工藝流程。這些流程需要與實際工藝流程相符或條件更為嚴格，確保細菌截留實驗完全按照或者更高于實際工藝制定。
細菌培養(yǎng)和篩選：細菌截留試驗采用缺陷假單胞菌（Brevundimonas diminuta, ATCC 19146），要求通過光學(xué)顯微鏡或者掃描電鏡觀察，直徑為0.3~0.4mm，長度為0.6~1.0mm，且呈單分散狀態(tài)，這些重要特性需每次進行觀察和篩選，以免對截留試驗造成影響。
膜片準備：根據(jù)PDA26號報告，至少應(yīng)該選擇3個批號濾膜，且需有1個批號的濾膜靠近該膜片的最小臨界值。在進行細菌挑戰(zhàn)前和后，這些膜片應(yīng)進行完整性測試，數(shù)值需符合或超出濾芯廠家給出的判定值，最終將結(jié)果記錄于報告中。表1是3M中國有限公司為某藥廠做的驗證服務(wù)記錄的相關(guān)數(shù)據(jù)，包含了細菌截留前和后的完整性數(shù)據(jù)，且都符合濾芯廠家給出的參考值。
環(huán)境要求：為了消除周圍環(huán)境菌的影響，避免對后期的分析造成干擾，試驗要求在專門的微生物潔凈室內(nèi)（class100000）進行，具體的整個試驗過程在二級生物安全柜中進行，且整個潔凈間需要定期進行消毒。
除菌過濾濾芯的選擇：目前液體除菌濾芯主要有聚醚砜膜（PES）濾芯（圖2），尼龍膜（Nylon）濾芯（圖3），聚偏氟乙烯膜（PVDF）濾芯，聚四氟乙烯膜（PTFE）濾芯等。濾膜又分親水膜和疏水膜，對于部分有機相溶劑料液，需要根據(jù)實際要求采用疏水膜過濾濾芯。在除菌濾芯的選擇上，藥廠主要根據(jù)濾芯供應(yīng)商推薦或者依賴某個品牌。其實除菌濾芯選擇主要是由以下幾個因素決定的：濾芯材質(zhì)（化學(xué)兼容性）；細菌截留率；流速；使用壽命；熱穩(wěn)定性；化學(xué)穩(wěn)定性。這也再次論證了濾芯驗證服務(wù)的重要性。
實驗介紹
根據(jù)ASTM838-83對除菌級濾芯的定義，用107CFU/cm2的缺陷性假單胞菌（ATCC 19146）進行試驗，下游濾出液無菌。細菌挑戰(zhàn)試驗研究的目的就是通過實驗獲得文件證據(jù)，證明在模擬工藝條件下，過濾過程可以持續(xù)去除懸浮于產(chǎn)品或替代流體中的高水平標準細菌或相關(guān)微生物污染分離物。
細菌截留試驗進行前，需要先進行細菌存活性試驗，來了解客戶產(chǎn)品在模擬的工藝條件下對截留菌生長的影響，如果客戶產(chǎn)品在模擬工藝條件下，會對截留菌生長造成影響，甚至無法存活，那么分析濾膜未發(fā)現(xiàn)截留菌，是產(chǎn)品對截留菌造成影響還是測試濾膜過濾的緣故都無從而知，因此細菌存活性試驗是截留試驗的預(yù)實驗，可以為截留試驗提供重要的理論依據(jù)，以此來確定截留試驗的過程，是采用單步還是多步進行試驗。
細菌截留試驗測試過程中使用如圖2所示裝置，一共包括CTL1-4四套截留裝置，CTL1-3即為所要驗證濾芯的3個重復(fù)，CTL-4為整個實驗的對照組，其中TF1、2、3分別為不同批號的測試濾膜，為過濾精度為0.22μm或者0.2μm的除菌濾膜，且每個TF上下游都加裝壓力表，用于監(jiān)控整個實驗過程中，測試濾膜兩端的壓力，TF4為對照，是過濾精度為0.45mm的濾膜，AF-1、2、3、4均為分析濾膜。實驗過程中將產(chǎn)品或者替代液配置成一定濃度的挑戰(zhàn)液，一般要求不低于107CFU/cm2，按照模擬的縮小化工藝條件，采用蠕動泵將其按照一定的速度通過測試和分析濾膜。在試驗過程中，需要在不同時間點對壓力、流速、溫度等關(guān)鍵參數(shù)進行監(jiān)控并記錄，且在細菌截留試驗開始前和結(jié)束后，對微生物進行平板菌落計數(shù)確定挑戰(zhàn)菌的濃度。
當截留試驗結(jié)束后，需要將分析濾膜放于平板上培養(yǎng)，如果上游的測試濾膜為除菌濾膜，即圖中的TF1、2、3，則下游的分析濾膜上不會發(fā)現(xiàn)截留菌生長，如果上游的測試濾膜為非除菌濾膜即TF-4，則下游的分析濾膜上會發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)菌生長。根據(jù)分析濾膜上是否有挑戰(zhàn)菌生長進行判斷，對照CTL-4，因0.45mm濾膜對挑戰(zhàn)菌濃度在104~106CFU/cm2時，無法達到除菌過濾的效果，所以對照組下游的分析濾膜，即AF-4必定會有挑戰(zhàn)菌的生長，這樣既可對挑戰(zhàn)菌進行鑒定，鑒定該挑戰(zhàn)菌的純度及形態(tài)特征，也可判斷挑戰(zhàn)液的濃度是否已經(jīng)達到預(yù)期的濃度。
實驗結(jié)果與分析
細菌截留實驗結(jié)果包括細菌截留前后膜片完整性測試值、陰性對照結(jié)果、產(chǎn)品循環(huán)工藝參數(shù)和分析膜片結(jié)果4個部分。如表1記錄了實驗?zāi)て暾詼y試結(jié)果，從中可以對截留試驗前和后，濾膜的完整性數(shù)據(jù)進行評估，是否符合濾芯廠家對于該類濾芯的完整性要求。
表2為陰性對照結(jié)果，需要確認在未接種截留菌前整個截留裝置是否保持無菌。表3為分析濾膜結(jié)果，也是決定細菌截留試驗成敗的關(guān)鍵指標，分為兩部分，第一部分為截留菌的濃度，需按要求菌不低于107CFU/cm2，可以分析達到了ASTM-838對除菌級濾芯截留濃度的要求，另外一部分為分析濾膜的結(jié)果，對于TCL-1、2、3裝置中AF均未發(fā)現(xiàn)截留菌，說明TF可以恒定高效的去除挑戰(zhàn)液中的截留菌，對于對照組的TCL-4下游的AF4，則發(fā)現(xiàn)有截留菌生長，可以利用特定的鑒定試劑盒，對結(jié)果進行鑒定，確認下游所發(fā)現(xiàn)的細菌有且僅為標準截留菌。
實驗結(jié)論
通過實驗結(jié)果的闡述和分析，需要對此次細菌驗證實驗進行總結(jié)。3M中國有限公司提供的細菌截留實驗結(jié)論如下：
1.某公司使用3M除菌濾芯（如LifeASSURE PDA PDA020F50JA）進行某藥液的除菌過濾。試驗在3M中國過濾驗證服務(wù)中心進行，本報告闡述了在模擬生產(chǎn)工藝條件下細菌挑戰(zhàn)試驗的測試結(jié)果。
2.當缺陷性假單胞菌的挑戰(zhàn)濃度高于107CFU/cm2時，所有測試膜片的濾出液全部無菌，測試結(jié)果符合判定標準。
3.某公司在某藥液生產(chǎn)中使用LifeASSURE PDA PDA020F50JA濾芯進行除菌過濾，可以去除高水平負荷的缺陷性假單胞菌（ATCC19146）。
