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液態(tài)活檢（liquid biopsy）

液態(tài)活檢這一概念最早在1974年由Sorrells等提出。液態(tài)活檢主要檢測對象包括：循環(huán)腫瘤細胞（CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）以及腫瘤外泌體（exosome）等，它們來源于腫瘤組織，存在于血液，可以提示腫瘤發(fā)展進程及抗藥性等信息，指導(dǎo)個體化精準(zhǔn)治療。與現(xiàn)有腫瘤檢測方法相比，液態(tài)活檢無侵入性、可頻繁多次檢測及快速反應(yīng)能力均體現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，應(yīng)用發(fā)展?jié)摿薮蟆某杀镜慕嵌龋t(yī)療保險有較大的動力推動液態(tài)活檢的CTC與ctDNA技術(shù)對穿刺活檢技術(shù)的替代。癌癥液態(tài)活檢也將幫助削減無效醫(yī)療開支、降低醫(yī)療成本、幫助醫(yī)保控費。

美國紀念斯隆-凱特林癌癥中心主任醫(yī)師兼首席醫(yī)療官約瑟·巴塞戈稱：“液態(tài)活檢可能永久改變活檢方式，包括對治療方案的響應(yīng)、抗藥性的出現(xiàn)，將來甚至還能用于早期診斷”。2015年2月白宮官網(wǎng)發(fā)布的相關(guān)細節(jié)中，腫瘤治療計劃的四大舉措之一就是：美國將使用“液態(tài)活檢”血漿開發(fā)新方法來評估治療反應(yīng)以及抵抗可能的耐藥性。

根據(jù)中國國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，我國5年內(nèi)診斷為癌癥且仍存活的病例數(shù)約為749萬。液態(tài)活檢臨床實驗的適應(yīng)癥廣泛，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、胃癌、食管癌等常見腫瘤均可用液態(tài)活檢技術(shù)進行診斷與監(jiān)測。在我國存量腫瘤患者中，適合使用液態(tài)活檢技術(shù)的腫瘤病人至少為542萬人，占比達到72%。預(yù)計液態(tài)活檢的目標(biāo)患者人數(shù)為500萬人。在同時考慮我國腫瘤發(fā)病率、液態(tài)活檢適應(yīng)癥、未來市場滲透率、未來檢測單價以及患者年平均檢測次數(shù)等因素后，預(yù)測中國液態(tài)活檢市場在5-10年內(nèi)的市場潛力約為200億元。

另外，由于血液中腫瘤DNA的量與腫瘤的大小和階段大致成比例，這種檢測也可用來判斷手術(shù)或藥物治療的效果。對于組織活檢難以進行的疾病，如肺癌，液態(tài)活檢特別有用（圖1）。

圖1. 液態(tài)活檢在腫瘤（肺癌）中的應(yīng)用

一、液態(tài)活檢之循環(huán)腫瘤DNA研究進展及技術(shù)平臺簡介

（一）循環(huán)腫瘤DNA （ctDNA）簡介

血漿游離循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）是由腫瘤細胞釋放到血漿中的單鏈或者雙鏈DNA，對ctDNA進行檢測，可以對腫瘤負荷進行實時監(jiān)控、藥物療效反應(yīng)與預(yù)后判斷等。腫瘤細胞壞死或者凋亡后，細胞中的DNA釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，游離地存在于血液當(dāng)中（圖2）。雖然這些DNA是斷裂的，不完整的，但它來自于腫瘤細胞，如果腫瘤細胞攜帶某種基因突變，這些突變也能在ctDNA中反應(yīng)出來。通過檢測ctDNA的基因突變，就可以揭秘體內(nèi)腫瘤組織的突變信息，從而為腫瘤的靶向治療和藥效檢測提供依據(jù)。

圖2.循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）來源

ctDNA可能比蛋白質(zhì)生物標(biāo)識表現(xiàn)得更好。蛋白質(zhì)被用于臨床疾病診斷，并對正在接受治療的患者進行監(jiān)控。例如，前列腺特異性抗原（PSA）是前列腺腫瘤的生物標(biāo)識，但它卻會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因為出于其他原因，這種抗原在血液中的含量也會升高。但ctDNA出現(xiàn)假陽性的幾率更低，因為它是由具有癌細胞印記的突變和其他遺傳變化定義的。盡管大多數(shù)蛋白質(zhì)生物標(biāo)識能在血液中存在數(shù)周，而ctDNA的半衰期不到兩個小時，因此，后者呈現(xiàn)的是腫瘤實時的情況。劍橋團隊與約翰斯·霍普金斯團隊分別發(fā)現(xiàn)，在監(jiān)測乳癌和腸癌時，與蛋白質(zhì)生物標(biāo)識相比，ctDNA更加敏感，并且在追蹤腫瘤消失、擴散和復(fù)發(fā)時，ctDNA也更準(zhǔn)確。另外，這兩個小組還發(fā)現(xiàn)，ctDNA比循環(huán)腫瘤細胞更敏感。在實驗中，Diaz研究小組發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩者都存在時，ctDNA碎片在數(shù)量上要超過循環(huán)腫瘤細胞（50：1）。在過去十年，高通量測序技術(shù)（又稱為二代測序技術(shù)）迅速發(fā)展，并成功應(yīng)用于遺傳性疾病及腫瘤的診斷。如能將高通量測序技術(shù)運用在液態(tài)活檢上，將為分子診斷開拓一個更為廣闊的天地。高通量測序檢測ctDNA技術(shù)只需要少量的外周血，就可以檢測出腫瘤DNA中的突變。

由于ctDNA的二代測序檢測準(zhǔn)確、靈敏、無創(chuàng)且高通量，目前已用于靶向治療的實時監(jiān)測。英國癌癥研究所Bono實驗室發(fā)表在《臨床癌癥研究》（ClinicalCancer Research）上的文章報道了ctDNA的二代測序檢測在監(jiān)測靶向藥物療效中的應(yīng)用。該研究來自一個針對PI3K-AKT-mTOR信號通路的靶向藥物的臨床實驗，共39位癌癥患者參與此項研究，在服藥前已有不同程度的癌細胞轉(zhuǎn)移跡象。首先，該研究證明外周血ctDNA中檢測到的突變均在手術(shù)活檢樣品中出現(xiàn)，說明ctDNA可以反應(yīng)腫瘤組織分子水平變化。

圖3.循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）測序

接下來，在服用靶向藥物過程中，每隔一段時間收集外周血進行ctDNA測序，用以監(jiān)控上述信號通路中的熱點突變的變化，從而為判斷藥物的療效提供依據(jù)，結(jié)果顯示，ctDNA突變的變化趨勢與傳統(tǒng)CT檢測到的腫瘤大小變化基本一致，實現(xiàn)了腫瘤分子水平監(jiān)控。靶向藥物針對基因突變而設(shè)計，因此ctDNA中的突變變化可以更靈敏準(zhǔn)確地判斷靶向藥物的療效。

（二）ctDNA研究進展

當(dāng)前的分子診斷技術(shù)主要還是基于細針穿刺，其面臨的技術(shù)局限是靈敏度問題。由于腫瘤的異質(zhì)性，細針穿刺所取到的少量樣本往往無法反映腫瘤突變的全貌，也可能會遺漏惡性的亞克隆。某些實體瘤如肺癌，穿刺取樣存在困難和風(fēng)險。所以，采用無創(chuàng)檢測手段對血液中的ctDNA進行檢測和測序，可以幫助人們通過取血得到更全面的癌癥信息，告訴醫(yī)生治療是否已經(jīng)起作用，腫瘤有沒有演化出抗性2,3。研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、肺癌、乳腺癌、大腸癌、肝癌、膀胱癌、宮頸癌、胰腺癌、卵巢癌等人類惡性腫瘤中均能檢測到ctDNA。目前針對ctDNA的研究主要包括以下四個方面：

1. 追蹤腫瘤進化

2015年發(fā)表于《NatureCommunications》雜志的一項新的研究，科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)，流進入血液中的腫瘤DNA，可用于實時跟蹤腫瘤的發(fā)展以及對治療的響應(yīng)4。

劍橋大學(xué)的研究人員從腫瘤已經(jīng)擴散到身體其他部位的一名ER、HER-2陽性的乳腺癌患者身上，在患者治療期間采集了8份腫瘤樣本（圖4-1）和9份血液樣本進行外顯子組和靶向擴增子測序。他們仔細研究了進入血液中的、來自死亡腫瘤細胞的小DNA片段，并將它們與在同一時間點上采集的活組織切片進行比較。

圖4-1.采集腫瘤樣本（活檢部位）

結(jié)果表明，血液樣本中的ctDNA與活檢相匹配，反映了當(dāng)腫瘤發(fā)展和響應(yīng)治療時出現(xiàn)了相同的模式和遺傳變化時機。這些結(jié)果提供了第一個原理證明，分析了血液中的ctDNA，可以準(zhǔn)確地監(jiān)測體內(nèi)的癌癥。使用PyClone的貝葉斯聚類分析發(fā)現(xiàn)8個主要的突變簇，并繪制出腫瘤進化的系統(tǒng)樹（圖4-2）。

圖4-2.腫瘤進化樹

本次研究的結(jié)果預(yù)示：在利用ctDNA實時監(jiān)控腫瘤負荷方面，具有在血漿中豐度最高，在隨訪過程中不易丟失等優(yōu)勢的軀干突變基因（truncal mutations）將是最好的候選靶標(biāo)。同時，藥物治療前血漿中的耐藥相關(guān)的ctDNA突變可能為治療方案的選擇提供依據(jù)。

2.耐藥機制研究

腫瘤的靶向治療顯著提升了患者的臨床治療效果，然而不幸的是大部分患者都會產(chǎn)生獲得性治療抵抗。阻礙臨床患者治療的一大主要問題是對于耐藥機制的理解5,6。2016年發(fā)表的兩項研究顯示血漿游離DNA分析能夠成功檢測出非小細胞肺癌和結(jié)直腸癌種EGFR靶向治療的異質(zhì)性耐藥機制5。

圖5.患者血漿游離DNA采集

本研究通過對EGFR TKI AZD9291耐藥的肺癌的無細胞血清DNA （cfDNA）的研究，利用高通量測序技術(shù)（next generation sequencing, NGS），發(fā)現(xiàn)在7個病人中有一個有EGFR C797S突變把這種突變加入肺癌細胞系中，能導(dǎo)致肺癌細胞對AZD9291產(chǎn)生耐藥。隨后進行了微滴式數(shù)字PCR （ddPCR），對15個經(jīng)過AZD9291治療的病人的無細胞血清DNA （cfDNA）進行了檢測，發(fā)現(xiàn)他們在治療之前全都有T790M突變，但是接受AZD9291治療并耐藥后，6個病人產(chǎn)生了EGFR C797S突變，5個病人保持了T790M突變但是沒有C797S突變，4個病人失去了T790M突變，但是依然有EGFR通路的激活7。該研究表明，在治療初期的克隆會隨著時間波動，無細胞血清DNA （cfDNA）監(jiān)測有助于腫瘤負荷的檢測以及治療反應(yīng)的判斷。

3.  預(yù)后評估

2013年發(fā)表于《新英格蘭雜志》一篇研究報道：在對30名轉(zhuǎn)移性乳腺癌腫瘤患者檢測中，97%可成功檢出ctDNA；78%可檢出CA 15-3，87%可檢出循環(huán)腫瘤細胞8-10。ctDNA水平顯示出動態(tài)范圍以及與腫瘤負荷的關(guān)聯(lián)性均大于CA 15-3或循環(huán)腫瘤細胞（CTC）。ctDNA為53%的患者提供了最早的治療反應(yīng)監(jiān)測指標(biāo)。該研究表明，ctDNA攜帶腫瘤特異性變異，與現(xiàn)有FDA批準(zhǔn)的生物標(biāo)記物和CTC相比，能更有效監(jiān)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌。

4.藥物療效反應(yīng)

2014年發(fā)表于《Sci Transl Med 》上的一篇研究報道：對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者治療前后血液樣本中血漿游離循環(huán)腫瘤DNA分別進行全基因組、全外顯子組或者目標(biāo)區(qū)域高通量測序，能夠發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)治療前后的不同的基因發(fā)生了一種或多種突變，這些新出現(xiàn)的突變可能是導(dǎo)致藥物耐藥的原因之一11。當(dāng)患者樣本量積累到足夠大時，可以有助于鑒定腫瘤耐藥或復(fù)發(fā)相關(guān)的基因或通路。

圖6. ctDNA水平與療效監(jiān)控及預(yù)后評估

（三）ctDNA研究策略簡介

在實體瘤患者治療前、治療后與隨訪期間按照不同時間點多次采集外周血樣本，分別對血漿ctDNA進行ddPCR檢測或者全外顯子組、目標(biāo)區(qū)域高通量測序。不同時期的外周血樣本基因突變類型與基因突變頻率可以反映患者在治療期間的病情進展、對藥物療效的反應(yīng)以及可能的預(yù)后信息。當(dāng)患者樣本量積累到足夠大時，可以有助于鑒定腫瘤耐藥或復(fù)發(fā)相關(guān)的基因或通路。

圖8.ctDNA研究策略

（四）總結(jié)與展望

生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)是一個不斷發(fā)展的領(lǐng)域，分析和診斷的敏感性需得到進一步提高，以便分析ctDNA的特定突變基因。此外關(guān)于腫瘤的異質(zhì)性方面即檢測出的血漿ctDNA可反映全部的不同轉(zhuǎn)移部位腫瘤的突變情況還是僅代表影響疾病進展和治療抵抗的最重要的DNA突變則有待更深入地研究17。隨著技術(shù)的進步和成本的降低，全基因組測序可能成為檢驗醫(yī)學(xué)的常規(guī)工具。同時分析血漿DNA的一系列過程則需進行標(biāo)準(zhǔn)化，并提高檢測方法的敏感性18。

如今ctDNA技術(shù)尚未運用于臨床實踐，許多機制尚不十分清楚11。目前臨床尚未開展多中心、大樣本的基礎(chǔ)以及臨床研究，缺乏有價值的科研資料來指導(dǎo)臨床，但隨著廣大科研工作人員對 ctDNA的不斷探索和研究，ctDNA 將可能成為臨床腫瘤學(xué)中一種具有重要意義的生物標(biāo)志物。綜上所述，ctDNA技術(shù)作為一種方便、非侵入性、可重復(fù)性和高敏感性的“液態(tài)活檢”技術(shù)，能夠了解循環(huán)中腫瘤特異性突變，在腫瘤的早期診斷、療效評估、復(fù)發(fā)和預(yù)后判斷等方面發(fā)揮著重要的作用。以形態(tài)病理學(xué)為基礎(chǔ)，以分子病理學(xué)為輔助。兩者相輔相成，液態(tài)活檢將為人類更深入地了解疾病的本質(zhì)提供更豐富的、可靠的手段5。

在未來，ctDNA結(jié)合ddPCR技術(shù)或者新一代測序技術(shù)將有望實現(xiàn)：

1.早期篩查：在影像學(xué)未發(fā)現(xiàn)病灶時對被檢測者進行早期篩查，判斷腫瘤原發(fā)灶；

2.實時監(jiān)控：ctDNA檢測作為一種無創(chuàng)的檢測方法，能夠真實的反映實體瘤組織中的基因突變圖譜與頻率，并且能夠進一步為患者提供最早的實時監(jiān)控檢測指標(biāo)；

3.治療反應(yīng)：在治療前后分別檢測患者的ctDNA，可以及時檢測患者體內(nèi)的實體瘤相關(guān)基因的突變圖譜及頻率，監(jiān)測患者的腫瘤負荷及對治療的敏感性與耐藥性；

4.判斷預(yù)后：在治療前或治療后，對患者體內(nèi)實體瘤相關(guān)基因進行監(jiān)測，可以評估腫瘤特異性變異的突變頻率，對醫(yī)生判斷患者的預(yù)后起到指導(dǎo)作用。

二、液態(tài)活檢之循環(huán)腫瘤細胞（CTC）研究進展及技術(shù)平臺簡介

（一）CTC基礎(chǔ)知識

1.CTC的基本概念

1869年，澳大利亞學(xué)者Ashworth在一例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者血液中首次觀察到從實體腫瘤中脫離并進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，并首次提出了循環(huán)腫瘤細胞（CTC）的概念1。1976年，Nowell將CTC的定義修正為：來源于原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤，獲得脫離基底膜的能力并入侵通過組織基質(zhì)進入血管的腫瘤細胞。上世紀90年代，科學(xué)家開始對CTC的臨床意義進行研究。2000后，CTC日益成為臨床上液態(tài)活檢標(biāo)志物的研究熱點，并在臨床越來越廣泛的應(yīng)用3,4。

2.CTC的特點3-5

2.1可能是單個細胞從病灶脫落進入外周血，也可能是成簇脫落；

2.2不同CTC在形態(tài)上有較大差別；

2.3CTC有很強的異質(zhì)性，不同類型的腫瘤CTC差別很大，即使同一病人來源的不同CTC細胞表所表達的標(biāo)志物種類及表達量也有差異；

2.4CTC可能在循環(huán)過程中發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）逐漸喪失上皮標(biāo)志物；

2.5血液中存在可檢測CTC的患者比例隨癌癥類型的不同而不同。比如結(jié)直腸癌、卵巢癌和乳腺癌大約是50-70%，而非小細胞肺癌則低至30%；

2.6CTC活力強，有抗脫巢凋亡活性；

2.7CTC有侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。

圖1. CTC的特點

（二）CTC檢測技術(shù)

血液中大部分成分是白細胞和紅細胞，CTC所占的比例相對較少。每10mL血液中，含有1億個白細胞和500億個左右紅細胞，而CTC的數(shù)目可能僅有幾個到幾十個。想要準(zhǔn)確地檢測CTC細胞數(shù)目依賴非常靈敏的檢測手段。近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的進步和CTC臨床應(yīng)用價值凸顯，許多研究機構(gòu)和研發(fā)團隊都在推出不同的CTC檢測技術(shù)。CTC檢測技術(shù)包括CTC的富集（分離）和CTC的分析鑒定（識別）等5。

1、CTC富集（分離）

1.1 免疫親和法

建立在免疫親和原理上的CTC富集方法，利用特異性抗體與細胞表面抗原進行特異性結(jié)合來富集CTC。基于免疫親和的方法也分為很多種5：

1.1.1免疫磁珠法：以CellSearch?法為代表，在磁珠上包被細胞表面粘附分子EpCAM，來捕獲CTC。臨床研究證明該方法檢測出的CTC數(shù)目與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。FDA已批準(zhǔn)CellSearch?檢測的CTC數(shù)目用于預(yù)測轉(zhuǎn)移性乳腺癌，前列腺癌，結(jié)直腸癌的預(yù)后。

1.1.2微流體法：Nagrath和Toner的團隊研發(fā)了一種用于捕獲CTC的微流體。上面有78，000個微柱與EpCAM的抗體相結(jié)合，可直接捕獲全血中的CTC。整個微流體共有970 mm2的表面積，在2mL/hour的通量下，CTC捕獲效率>60%，特異性在50%左右。在多種轉(zhuǎn)移腫瘤中該方法已被證明有較高的CTC捕獲效率。

1.1.3納米結(jié)構(gòu)基體：Wang et al等人將EpCAM抗體結(jié)合在硅質(zhì)的納米基體上，進行CTC捕獲。1mL/hour的通量下，可以達到95%以上的捕獲效率。一項研究利用該方法對26例前列腺癌進行檢測，CTC的檢出率為20/26，明顯高于CellSearch?系統(tǒng)（8/26）。

1.1.4微量離心管：由Hughes et al研制，在微量離心管上包被EpCAM及PSMA的抗體，4.8mL/hour的通量下，捕獲率可達50%，特異性達66%。用該方法對14例轉(zhuǎn)移性腫瘤患者進行CTC檢測，檢出率為100%，明顯高于CellSearch?系統(tǒng)（9/14）。

1.1.5體內(nèi)富集：將結(jié)合EpCAM的裝置從前臂靜脈插入病人體內(nèi)，并停留30min，從而進行體內(nèi)CTC富集。臨床實驗證明這種方法對乳腺癌和肺癌的CTC細胞均有較高的捕獲效率。

1.1.6白細胞去除法：屬于陰性富集法。用特異性抗體CD45，CD14等與白細胞結(jié)合，從而去除全血中的白細胞。該方法比其它富集方法捕獲效率更高，但特異性明顯低于其它方法。

利用抗原抗體相互作用原理的CTC富集方法可得到較高的純度。但捕獲效率對細胞表面抗原的表達情況依賴較明顯。對于依賴EpCAM的捕獲方法，CTC捕獲效率與細胞表皮抗原的表達情況密切相關(guān)，一些CTC可能由于EMT過程中表皮抗原發(fā)生變化而未被捕獲。另外EpCAM法僅限于對上皮來源的CTC進行檢測。相對于其它方法，免疫親和法對CTC的富集效率偏低。

1.2 物理特性富集法

依據(jù)CTC的物理特性，如密度、大小、可變形性及表面電荷等進行富集。

1.2.1密度梯度離心：非常廉價高效的CTC分離方法，可將CTC與白細胞和紅細胞分離。目前市場上有較多的依賴密度梯度離心進行CTC富集的試劑盒，如Ficoll-Paque?solution （PharmaciaFine Chemicals, Uppsala, Sweden） ， OncoQuick?（Grenier BioOne, Frickenhausen, Germany）等。臨床實驗證明，密度梯度離心富集CTC比CellSearch?系統(tǒng)效率更高。

1.2.2微孔過濾：依據(jù)CTC體積大于血細胞的特性，對CTC進行捕獲。該技術(shù)已在轉(zhuǎn)移性肝癌，肺癌，前列腺癌，黑色素瘤等腫瘤中被證明有效。捕獲效率高于CellSearch?系統(tǒng)。

1.2.3微流控芯片：最初由Tan和 Lim團隊研發(fā)，針對CTC的體積和可變形性，CTC的捕獲率和特異性均可達到80%以上。在Tan和 Lim研究的基礎(chǔ)上，研究者們又發(fā)展了不少改進型的微流控芯片。

1.2.4介電電流：由于CTC與血細胞所攜帶的電荷不同，在雙向電泳的條件下，可將CTC有效捕獲（95%）。目前該技術(shù)主要對細胞株進行研究，臨床標(biāo)本的研究相對較少。

物理特性富集法操作簡單，成本低廉，不依賴細胞表面抗元的表達，捕獲效率較高，但相比其它方法，所富集的CTC純度較低。

圖2. CTC分離、富集及檢測

2.CTC分析鑒定

利用免疫親和或物理特性法可富集到CTC，這只是研究CTC的第一步，還需要結(jié)合有效的下游分析方法。一方面由于目前CTC捕獲技術(shù)不能保證百分之百的純度，需要對所得到的細胞進行鑒定，以進一步確定CTC細胞的數(shù)目，以減少CTC數(shù)目判定的假陽性率和假陰性率。另一方面在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，不僅CTC的數(shù)目在動態(tài)的變化，CTC所攜帶的分子標(biāo)志物也在變化，通過對CTC表面標(biāo)志物檢測，能夠反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化，是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的有效策略，并能很好地指導(dǎo)臨床治療。常用的CTC分析鑒定技術(shù)如免疫熒光、PCR、 FISH及高通量測序等。

2.1免疫熒光法（IF）

IF可用于檢測CTC表面分子標(biāo)志物的表達情況。CellSearch?系統(tǒng)應(yīng)用了免疫熒光對CTC進行鑒定。EpCAM +、CK +、DAPI+、CD45 -的細胞被判定為CTC，而EpCAM +、CK +、DAPI+、CD45 +的細胞不被判定為CTC。在科研方面有非常多的免疫熒光法結(jié)合CTC的研究案例。Baccelli等在各自的研究中對富集的CTC進行干細胞相關(guān)標(biāo)志物CD44，CD24, CD133,ALDH1等的檢測。Armstrong等在各自的研究中對富集的CTC進行表皮間質(zhì)細胞相關(guān)標(biāo)志物，TWIST, AKT2, PIK3α，N-cadherin and vimentin等進行檢測。Ignatiadis等用IF檢測了乳腺癌CTC中HER2的表達。Shaffer 等分別檢測了前列腺癌中EGFR和AR基因的表達。

2.2熒光原位雜交（FISH）

FISH技術(shù)亦可以與CTC非常好的結(jié)合，不僅可以檢測CTC表面標(biāo)志物，亦可以檢測CTC細胞內(nèi)部的標(biāo)志物及核型等。I-FISH CTC檢測系統(tǒng)利用白細胞去除法富集CTC后，用FISH法對細胞的核型進行判斷，將異倍體陽性，表面EpCAM陽性，和DAPI陽性的細胞定義為CTC。Attard G等6，對89例乳腺癌患者進行研究，在治療過程中每個月提取一次CTC，并用FISH技術(shù)檢測TMPRSS2-ERG融合基因，AR和PTEN拷貝數(shù)變化，該研究發(fā)現(xiàn)CTC表面標(biāo)志物與組織活檢有高度的一致性，并最終分析出在前列腺癌治療過程中，上述基因的動態(tài)變化。另一個典型的例子是Pailler E等7發(fā)表在J Clin Oncol上的一項研究。研究對象是18例組織檢測ALK融合基因陽性和14例組織檢測ALK融合基因陰性的肺癌患者。結(jié)果表明組織檢測ALK融合基因陽性患者體內(nèi)可檢測到ALK融合基因陽性的CTC，這些ALK融合基因陽性的CTC在融合位點方面有很強的異質(zhì)性，各種類型的CTC所占比例在crizotinib治療過程中動態(tài)變化。

2.3基于PCR的檢測方法

CTC富集結(jié)合RT-PCR可同時對若干個基因的表達進行檢測。Sieuwerts等8對50例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者進行研究，術(shù)前采集CTC，其中CTC數(shù)目的大于5的患者為32例。接下來用RT-PCR法檢測55個mRNA和10個miRNA，依據(jù)這些基因的表達情況，將轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者分成四類，每類患者的惡性程度和預(yù)后是不同的。這種分類方法比依賴HER2和ER進行分類能更好地指導(dǎo)臨床。Chang K等對75例前列腺癌患者進行研究，統(tǒng)計外周血中CTC的數(shù)目，并檢測CTC所含的干細胞相關(guān)基因（ABCG2，PROM1，PSCA）和EMT相關(guān)基因（TWIST1和vimentin）的表達情況，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CTC中干細胞相關(guān)基因的表達情況可作為前列腺癌的預(yù)后指標(biāo)。位點特異性PCR技術(shù)可用于檢測CTC攜帶的驅(qū)動基因的突變情況。例如，MaheswaranS等9對接受酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療的非小細胞肺癌患者進行CTC檢測，在統(tǒng)計CTC的數(shù)目的同時，對CTC攜帶的EGFR激活突變進行檢測，統(tǒng)計結(jié)果表明，攜帶T790M突變CTC的患者表現(xiàn)出明顯的TKI耐藥，且無進展生存期明顯低于不攜帶T790M突變CTC的患者（7.7 months vs 16.5months, p<0.001）。<>

2.4高通量單細胞測序

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，對單個CTC細胞進行測序具有了可行性。CTC單細胞測序首先依賴于單細胞擴增技術(shù)。比較有代表性的是哈佛大學(xué)謝曉亮團隊研發(fā)的多重退火和成環(huán)循環(huán)擴增技術(shù)（MALBAC）。該技術(shù)能從一個細胞的基因組中，分離出來自單細胞的DNA，然后添加稱作引物的短DNA分子。這些引物可與DNA的隨意部分互補，從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當(dāng)DNA復(fù)制起點。MALBAC可以有效地降低PCR擴增偏倚，使得單細胞中93%的基因組能夠被測序。這種方法使得檢測單細胞中較小的DNA序列變異變得更容易，因此能夠發(fā)現(xiàn)個別細胞之間的遺傳差異10。這樣的差異可以幫助解釋癌癥惡化的機制，生殖細胞形成機制，甚至是個別神經(jīng)元的差異機制。另一種常用的單細胞擴增技術(shù)被稱作多重置換擴增（MDA）。該方法隨機設(shè)計引物，讓這些引物與基因組廣泛結(jié)合，同時使用特定的聚合酶，這種聚合酶能夠轉(zhuǎn)換與它自身附著在同一模板上的DNA鏈片段，形成一種反復(fù)分支結(jié)構(gòu)，擴增出大段DNA。單細胞擴增技術(shù)保證了足夠量的DNA進行高通量的檢測。目前不少課題組都發(fā)表了CTC單細胞高通量測序的相關(guān)文章，證明了CTC單細胞測序方法的可行性和有效性。例如HeitzerE等11對來自6例結(jié)直腸癌的37個CTC進行單細胞測序，Ni X等12對來自11例肺癌病人的24個CTC進行全基因組測序。

（三） CTC研究現(xiàn)狀

CTCs檢測是“液態(tài)活檢”的重要工具，是目前轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的熱點。大量的臨床研究結(jié)果提示，CTC具有重要的臨床應(yīng)用潛能。在許多惡性腫瘤如肺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、大腸癌等中均能發(fā)現(xiàn)CTCs（詳見延伸閱讀部分）。與傳統(tǒng)的影像學(xué)診斷、內(nèi)窺鏡檢查以及病理學(xué)診斷相比，CTC檢測具有明顯優(yōu)勢：（1）CTCs比傳統(tǒng)方法更敏感地發(fā)現(xiàn)腫瘤的變化，并對腫瘤患者的預(yù)后、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移進行監(jiān)控；（2）CTCs檢測是一種非侵入性的診斷工具，它的分離富集只需要抽取患者少量外周血，對患者無創(chuàng)，也無副作用，同一患者能夠反復(fù)多次采集。目前有關(guān)CTC的研究主要集中在早期篩查、輔助腫瘤分期、預(yù)后評估、個體化治療策略制定，療效及耐藥監(jiān)測、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移預(yù)警等方面。

1.腫瘤早期篩查

腫瘤的預(yù)后與發(fā)現(xiàn)時機密切相關(guān)。80%的腫瘤若能早期發(fā)現(xiàn)都可以治愈。影像學(xué)是目前臨床上最常用的腫瘤篩查手段，但影像學(xué)只能檢測3mm以上的腫瘤，對更微小的病灶不能分辨，因此難以做到腫瘤的早期診斷。血清標(biāo)志物也用于早期診斷，但目前可用于臨床的血清標(biāo)志物種類有限，靈敏度和特異性均不理想。在腫瘤早期診斷方面，CTC越來越引人關(guān)注。2007年ASCO將CTCs納入了腫瘤標(biāo)志物。

Tanaka等13將125例肺癌患者和25例肺部良性患者的CTC陽性率進行比較，發(fā)現(xiàn)肺癌患者陽性率明顯高于良性腫瘤患者陽性率（30.6%vs 12.0%），說明CTC檢測對肺癌診斷具有指導(dǎo)意義，有望成為高危患者早期篩查協(xié)助診治的重要手段。2014年法國巴斯德醫(yī)院Ilie等人的研究則證實CTCs檢測可用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者肺癌早期篩查。他們在3%（5/168）的COPD患者外周血中檢測到CTCs，而這些CTCs陽性的患者在隨后的1～4年內(nèi)的LDCT檢查中發(fā)現(xiàn)了肺部結(jié)節(jié)。

2.輔助腫瘤的分期分級

血液系統(tǒng)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是判斷臨床分期的標(biāo)準(zhǔn)之一。如果將外周血CTC計數(shù)作為臨床分期的一個參考條件，可增進對腫瘤分期的理解，有利于醫(yī)生制定腫瘤治療方案。

如Sastre等14對97例結(jié)直腸癌患者和30例健康對照者的CTC檢測分析發(fā)現(xiàn)，將CTCs≥2個/7.5 mL外周血定義為陽性，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者陽性率分別為20.7%、24.1%、 60.7%（P = 0.005），表明CTCs檢測有助于結(jié)直腸癌的輔助診斷和臨床分期，可作為TNM傳統(tǒng)分期系統(tǒng)的有效補充，從而指導(dǎo)下一步的治療。TodenhoferT等對83例膀胱癌患者和29例健康對照者的檢測分析發(fā)現(xiàn)，CTC在I期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者陽性率依次升高，并且CTC的EMT相關(guān)標(biāo)志物和干細胞相關(guān)標(biāo)志物的表達也在不同分期的膀胱癌患者中有顯著差別。由此可見，CTC的數(shù)目及表面標(biāo)志物表達與膀胱癌患者的分級顯著相關(guān)。KolostovaK等對118例卵巢癌患者進行CTC檢測分析發(fā)現(xiàn)，CTC數(shù)目與卵巢癌的惡性程度有明顯的相關(guān)性，與CA125的表達豐度也密切相關(guān)。

3.預(yù)后評估

目前，多種腫瘤中已發(fā)現(xiàn)CTC數(shù)目與預(yù)后密切相關(guān)。FDA批準(zhǔn)CellSearch?CTC檢測系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌的預(yù)后評估、無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）預(yù)測的產(chǎn)品。

2004年，Cristofanilli等15在一個多中心、前瞻性、雙盲臨床試驗中，用CellSearch?系統(tǒng)檢測177 例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者7.5 mL 外周血中CTCs 的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)治療前外周血中CTCs ≥5 個的患者治療后的中位PFS和OS均短于CTCs＜5個的患者，并且治療一周后CTCs數(shù)目增高患者的PFS和OS也顯著短于治療后CTC數(shù)目沒有升高的患者。這項研究發(fā)表在NEJM上，也正是基于此項研究，美國FDA批準(zhǔn)CTC用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的預(yù)后評估。我國學(xué)者江澤飛教授等人針對中國轉(zhuǎn)移性乳腺癌（MBC）患者進行的一項多中心研究首次發(fā)現(xiàn)，CTCs計數(shù)可為中國MBC患者提供較為確切的預(yù)后信息，并可作為PFS與OS相關(guān)的獨立因素。Cohen等16進行的一項前瞻性研究中，對430例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸患者分別在治療前后進行CTCs計數(shù)，發(fā)現(xiàn)以3個CTCs/7.5 mL外周血為閾值，CTCs≥3的患者組中位無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）均短于CTCs＜3的患者組。基于此項研究，F(xiàn)DA批準(zhǔn)CTCs計數(shù)為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的預(yù)后預(yù)測因子。此外，在非小細胞肺癌，肝細胞癌，胰腺癌，內(nèi)分泌瘤等腫瘤中，均觀察到，CTC數(shù)目與PFS或OS密切相關(guān)。CTC數(shù)目越多，患者的預(yù)后越差。

4.個體化治療策略制定

不同的個體由于致病性突變不同，對同一治療方案的反應(yīng)存在重大的差別，因此對患者進行個體化治療意義重大。傳統(tǒng)上對于腫瘤致病性突變是利用腫瘤組織活檢或手術(shù)取得的組織標(biāo)本進行檢測。但上述方法只能在特定時間點檢測，而且可能只對腫瘤組織的局部區(qū)域進行檢測，不能反應(yīng)腫瘤的動態(tài)變化，也很難反應(yīng)腫瘤組織中最具代表性的驅(qū)動突變。近年來，越來越多的證據(jù)證明，CTC檢測是對腫瘤進行個體化治療的有效手段。

Yen等17對76例轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進行研究，同時檢測CTC數(shù)目及CTC細胞KRAS的突變情況。經(jīng)統(tǒng)計，攜帶KRAS野生型CTC的患者在接受西妥昔單抗和化療聯(lián)合治療時比攜帶KRAS突變型CTC患者有更長的無進展生存期和總生存期。盡管CTC基因檢測結(jié)果與組織檢測結(jié)果有較高的一致性，但也有存在差異的情況。研究證明，當(dāng)CTC基因檢測結(jié)果與組織檢測結(jié)果不符時，CTC對個體化治療的指導(dǎo)意義更大。以乳腺癌為例，Pestrin等18對66例晚期乳腺癌患者進行CTC檢測。在CTC陽性的患者中，29%的HER2陰性乳腺癌患者體內(nèi)檢測到了HER2陽性的CTC，而37%的HER2陽性的乳腺癌患者體內(nèi)檢測到了HER2陰性的CTC。對組織檢測HER2陰性，CTC檢測HER2陽性的乳腺癌患者進行靶向治療，患者均從治療中獲益。

5.療效及耐藥監(jiān)控

對于惡性腫瘤患者，如何判斷治療（特別是化療）的有效性是臨床的熱點問題之一。影像學(xué)檢查只能針對化療無效且化療期間出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者給予判斷，對于病情是否出現(xiàn)好轉(zhuǎn)則大多無法在化療期間判斷。研究表明患者在治療前后CTCs的數(shù)量的變化及CTC分子標(biāo)志物的變化與腫瘤的療效評價體系有很好的對應(yīng)關(guān)系，CTC是對腫瘤療效監(jiān)控的有利工具。Pachmann等對30例均可檢測到CTCs的患者進行CTCs計數(shù)（每3個化療周期1次），結(jié)果發(fā)現(xiàn)CTCs計數(shù)減少與瘤體減小呈線性相關(guān)（R2=0.97），提示CTCs計數(shù)可作為評估新輔助化療療效的早期指標(biāo)。Okegawa等19對80例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者開始內(nèi)分泌治療前進行基線CTC計數(shù)，其中44例CTC計數(shù)≥5的患者內(nèi)分泌治療中位有效期為17個月，而CTC計數(shù)＜5的患者內(nèi)分泌治療中位有效期為32個月或以上，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.007），表明CTC計數(shù)是內(nèi)分泌治療的敏感預(yù)測因子，治療使CTC計數(shù)降低至＜5的患者從治療中獲益較大。另外Darshan等20研究發(fā)現(xiàn)CRPC患者外周血CTC中AR的亞細胞水平定位可以預(yù)測患者對多西他賽化療的反應(yīng)。他們在CRPC患者接受多西他賽化療期間，利用CellSearch?檢測系統(tǒng)分離其外周血中CTC，采用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記AR后在共聚焦顯微鏡下對AR進行亞細胞水平的定位，發(fā)現(xiàn)CRPC患者對多西他賽化療的反應(yīng)與AR的亞細胞水平定位有關(guān)，CTC胞質(zhì)及胞核中均有AR分布的患者可能對多西他賽化療反應(yīng)較差，應(yīng)更換其他治療方案。

腫瘤患者在經(jīng)過一段時間的化療治療后，相當(dāng)比例的病人會出現(xiàn)化療耐藥，過去只能在化療的隨診時才能回顧性評價。近年來，越來越多的研究表明，患者外周血內(nèi)CTC數(shù)目和基因表達是隨著患者治療過程而動態(tài)變化的，通過監(jiān)測血液中CTC數(shù)目變化及相關(guān)標(biāo)志物的變化，來實時監(jiān)測腫瘤藥物耐藥是一種非常有效的方法。KuhlmannJD等對接受鉑類治療的143例卵巢癌患者進行研究，用CellSearch?法進行CTC捕獲并結(jié)合Realtime，檢測CTC中ERCC1基因的表達，最終發(fā)現(xiàn)ERCC1（+）CTC是鉑類耐藥的預(yù)測因子（P = 0.010）。Gradilone A等對42例接受化療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌進行研究，在化療的不同階段，檢測CTC的數(shù)目及MRPs，ALDH1，HER2/ neu，ERα等基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)CTC 中MRPs 基因高水平表達的患者接受化療的效果較差。Li Y等利用I-FISH法對晚期胃癌患者的CTC進行檢測，發(fā)現(xiàn)有不同8號染色體倍性的CTCs與紫杉醇或者是鉑類化療的敏感性或者耐藥性相關(guān)。

6.腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期預(yù)警

腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是腫瘤致死的主要原因，對于多數(shù)腫瘤，若能早期檢測到轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，患者還有很大的治療機會。但傳統(tǒng)影像學(xué)檢測不能對腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)早期預(yù)警。

MD Anderson中心的研究者們對63例III期炎性乳癌患者進行了研究，在系統(tǒng)治療后，每隔一定時間段檢測CTC，平均隨訪時間為38個月。多元變量分析提示，在隨訪期間檢測到CTC的患者比CTC檢測結(jié)果陰性的患者有更早復(fù)發(fā)的風(fēng)險（HR=4.22，p=0.005）21。CTC既能單獨存在，亦可成簇存在，與單個CTC相比，CTC簇有更高的轉(zhuǎn)移潛能。哈佛醫(yī)學(xué)院的科學(xué)家們對乳腺癌患者體內(nèi)分離的單個CTC和CTC簇進行RNA測序。發(fā)現(xiàn)在CTC簇中，細胞粘附蛋白珠斑蛋白的表達水平明顯高于單個CTC細胞。動物模型實驗證明消減粘附蛋白能夠抑制轉(zhuǎn)移灶的形成。科學(xué)家們推測，單個CTC細胞領(lǐng)先珠斑蛋白相互粘附，形成CTC簇，增加了轉(zhuǎn)移潛能22。

（四）CTC研究的最新進展

CTC應(yīng)用于腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的研究有非常明顯的優(yōu)勢。一方面，CTC是由腫瘤組織脫落，進入外周循環(huán)系統(tǒng)的有活性的腫瘤細胞。CTC所攜帶的分子標(biāo)志與腫瘤組織活檢結(jié)果有高度的一致性，并且能反應(yīng)在某一階段起主導(dǎo)作用的分子生物學(xué)事件；另一方面，傳統(tǒng)的研究方式，受標(biāo)本采集所限，只能對腫瘤發(fā)展過程的少數(shù)幾個時間點進行研究。而CTC檢測作為液態(tài)活檢，可以反復(fù)，多次，無創(chuàng)地進行標(biāo)本采集，能夠完全地對腫瘤發(fā)生發(fā)展的全程進行研究。隨著CTC相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，CTC日益成為一種研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的有效工具。研究CTC在腫瘤不同階段數(shù)目和分子標(biāo)志物的變化是研究腫瘤發(fā)生發(fā)展動態(tài)過程的有效策略。

1.利用CTC檢測研究腫瘤的異質(zhì)性和克隆演化

腫瘤組織有明顯的異質(zhì)性，腫瘤組織不同細胞之前有不同的基因組背景，對不同階段CTC分子標(biāo)志物進行檢測能夠研究腫瘤的異質(zhì)性及克隆演化規(guī)律。2013年P(guān)roc Natl Acad SciU S A雜志上發(fā)表了一項針對肺癌CTC測序的研究結(jié)果。研究者從11例肺腺癌患者外周血中分離了24個個體CTC，用MALBAC進行基因組擴增，之后進行全基因組測序，并分析了拷貝數(shù)變異和單核苷酸變異。結(jié)果表明，不同患者之間CTC的基因組特征差別很大，從同一患者體內(nèi)分離出的不同CTC有一定差別，但與原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶序列之間有進化上的關(guān)系12。Jiang R等23對1例轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者不同時期外周血CTC、原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶進行全基因組測序。并比較了不同標(biāo)本中的驅(qū)動性突變的分布，證明不同CTC之間，CTC與原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶之間既有共性又有特性，存在進化關(guān)系。

圖3. CTC全基因組測序

2. 利用CTC檢測研究腫瘤的轉(zhuǎn)移機制

腫瘤的轉(zhuǎn)移機制長期以來是腫瘤研究的難點，而CTC檢測結(jié)合其它分子標(biāo)志物檢測技術(shù)能夠很好地反應(yīng)腫瘤從原發(fā)灶到轉(zhuǎn)移灶變化的動態(tài)過程。

在Yu M等24的研究中，對17例乳腺病人在不同時間點進行CTC采集，分離成單細胞，一部分進行CTC單細胞測序，一部分用Realtime PCR檢測表皮和間質(zhì)細胞標(biāo)志物，并與臨床數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，最終發(fā)現(xiàn)在發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，上皮細胞的表面標(biāo)志物逐漸減少，而間葉細胞表面標(biāo)志物逐漸增加，轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的CTC細胞間葉細胞標(biāo)志物的表達豐度明顯高于非轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者。一系列結(jié)果證實了乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中EMT假說，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2013年Science雜志上。Baccelli L等25將有干性（EpCAM+，CD44+，CD47+，MET+）的人原發(fā)性乳腺癌的CTC進行分離并注入裸鼠體內(nèi)，最終植入干性CTC的裸鼠體內(nèi)產(chǎn)生了骨，肺，肝等部位的轉(zhuǎn)移灶。接下來，作者在多例乳腺癌患者中檢測了CTC數(shù)目及CTC中干性標(biāo)志物的表達情況，結(jié)果提示，干性標(biāo)志物表達陽性的CTC越多，形成轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目越多，且患者的生存期越短（圖3）。

圖4. CTC與乳腺癌轉(zhuǎn)移

3. CTC細胞體外培養(yǎng)及個體化治療相關(guān)研究

CTC作為一種有活性的細胞，可以從體內(nèi)富集分離，并在體外擴增培養(yǎng)。很多實驗室都報道了體外成功進行CTC培養(yǎng)的案例。如Cayrefourcq 等成功地建立了結(jié)腸癌CTC細胞系，Gao等建立了前列腺癌的CTC細胞系，Zhang等建立了乳腺癌CTC細胞系。2014年，《Science》上的發(fā)表了一篇CTC相關(guān)的研究成果。研究者們從6例ER陽性的乳腺癌患者中分離出CTC細胞，進行體外擴增培養(yǎng)。成功培養(yǎng)的5個細胞系中有3個可以使裸鼠成瘤。

圖5. CTC細胞體外培養(yǎng)

對這些細胞系進行基因組測序發(fā)現(xiàn)了FGFR2，PIK3CA， ESR1等基因的驅(qū)動變異。隨后的藥敏實驗發(fā)現(xiàn)CTC藥物敏感性測量結(jié)果與臨床病史一致，包括紫杉醇和卡培他濱的敏感性，氟維司群和阿霉素的耐藥。CTC培養(yǎng)可以幫助惡性腫瘤患者在整個疾病過程中接受最好的治療。這篇文章充分說明了CTC培養(yǎng)的可行性和臨床意義26。

（五）CTC研究策略簡介：

CTC是目前液態(tài)活檢最重要的技術(shù)之一，研究CTC既能夠提高腫瘤的診療水平，又有助于反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展機制。下圖概況了CTC的研究策略。在腫瘤患者治療前及治療的不同時間點，采集外周血，檢測CTC數(shù)目，CTC基因突變或分子標(biāo)志物表達，最終與隨訪數(shù)據(jù)綜合統(tǒng)計分析。

圖6. CTC研究策略

（六）總結(jié)與展望

CTC作為一種重要的液態(tài)活檢技術(shù)顯現(xiàn)出非常大的應(yīng)用潛能，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的亮點。目前有關(guān)CTC的研究論文已經(jīng)接近兩萬篇。隨著CTC檢測技術(shù)的進一步完善，及CTC檢測成本的逐漸下降，CTC將會有越來越大的用武之地。

臨床上，盡管目前FDA僅批準(zhǔn)CTC對乳腺癌，前列腺癌，結(jié)直腸癌預(yù)后評估，越來越多的臨床研究證明CTC是有效腫瘤早篩、輔助診斷、預(yù)后評估、實時監(jiān)控和復(fù)發(fā)預(yù)警等方面的標(biāo)志物。隨著CTC檢測技術(shù)的成熟，及CTC相關(guān)臨床數(shù)據(jù)的積累，CTC檢測將會越來越多地寫進臨床指南（各種腫瘤與CTC研究詳見延伸閱讀部分）。

科研上，近年來單細胞測序、CTC培養(yǎng)等技術(shù)突飛猛進，CTC日益成為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的有效工具。尤其在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，依賴CTC技術(shù)，會有越來越多腫瘤轉(zhuǎn)移的機制被揭開。

三、腫瘤外泌體研究進展及技術(shù)平臺簡介（詳見腫瘤外泌體研究專輯）

（一）外泌體（Exosome）簡介

Exosome是由細胞內(nèi)多泡體與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質(zhì)中的一種直徑約30~120nm的膜性囊泡。Exosome的來源廣泛，除了網(wǎng)織紅細胞以外，T細胞、B細胞、血小板、樹突狀細胞、肥大細胞等血細胞及上皮細胞、腫瘤細胞等，被分泌出的Exosome會進入各種體液如羊水，腹水，鼻灌洗液，唾液，血清，血漿，乳汁，尿液，腦脊髓液等中，通過循環(huán)系統(tǒng)到達其他細胞與組織，產(chǎn)生遠程調(diào)控作用1,2。

Exosome內(nèi)含物的很大部分是蛋白質(zhì)，如：Annexins、CD9、CD63、CD81、MHC-I和Tsg101等；腫瘤細胞產(chǎn)生的Exosome中還可以檢測到過度表達的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，如FasL、TRAIL和TGF-β等腫瘤抗原和免疫抑制蛋白，這使得Exosome在腫瘤及相關(guān)疾病的診斷中具有重要的潛在應(yīng)用價值。除蛋白質(zhì)外，Exosome中還含有大量的mRNA、miRNA、lncRNA和cirRNA等3,4。

圖1. Exosome的組成（Zhang et al. Journal of Hematology &Oncology, 2015, 8:83）

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究和基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，已經(jīng)發(fā)展出一個Exosome數(shù)據(jù)庫（http://microvesicles.org; http://exocarta.org）。據(jù)檢測結(jié)果，細胞外囊泡可以攜帶92,897種蛋白質(zhì)，584種脂類分子，4,934 種miRNAs及27,642種mRNAs。腫瘤患者和自身免疫性疾病患者Exosome的含量比正常人要高，這表明其在各種疾病中的重要作用，目前，已有越來越多的學(xué)者開始關(guān)注Exosome在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機制。

（二）Exosome研究意義

1.Exosome與腫瘤的早期診斷

腫瘤在生長過程中會不斷地將Exosome釋放到周圍環(huán)境中去，同時，Exosome能在4℃保存96h，或是在-70℃下保存更長時間5，可以從患者血清或尿液等體液中分離Exosome用于早期臨床診斷。

1.1可作為胰腺癌診斷的生物標(biāo)志物

2015年，美國德克薩斯大學(xué)研究者Sonia A. Melo等人在Nature發(fā)文報道了他們基于Exosome標(biāo)志物所建立的主要依靠檢測一種錨定在血液中Exosome質(zhì)膜上的磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPC1）來實現(xiàn)非侵入性的胰腺癌診斷方法，這種方法可以非常精確地從良性胰腺疾病中診斷出早期癌變6。

圖2.GPC1+ Exosome與胰腺癌早期診斷

1.2可作為黑色素瘤診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物

Exosome中存在黑色素瘤標(biāo)志物包括MIA、S100B和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2（Tyrp2）等的潛在臨床應(yīng)用價值7。黑色素瘤患者胞外體中MIA和S100B濃度顯著高于健康對照人群和非黑色素瘤患者。在黑色素瘤患者胞外體中檢測到了MIA和S100B，對它們的量化具有診斷和預(yù)后的作用。

2. Exosome與腫瘤轉(zhuǎn)移

2.1Exosome連接“種子”和“土壤”

美國M.D. Anderson 腫瘤中心的Dihua Yu等發(fā)現(xiàn)正常表達PTEN的腫瘤細胞在腦部定植時，其PTEN的表達會降低，當(dāng)從腦部重新分離出來后，其PTEN表達水平會恢復(fù)。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到腦部后可以被神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌的Exosome所改造，其Exosome內(nèi)部攜帶大量的miRNA-19a可以靶向腫瘤細胞內(nèi)的PTEN mRNA從而影響腫瘤細胞內(nèi)PTEN的蛋白水平，進而影響CCL2和NF-kB等通路促進腫瘤細胞的增殖，提升腫瘤細胞的抗凋亡能力8。這一發(fā)現(xiàn)，印證了百年前Paget的假說，腦部特定的微環(huán)境正是適宜腫瘤“種子”生長的“土壤”。

圖3. Exosome與腫瘤細胞腦轉(zhuǎn)移

2.2決定腫瘤轉(zhuǎn)移的器官特異性

2015年《自然》（Nature）雜志上的一篇論文是第一項關(guān)于腫瘤分泌的Exosome在器官特異性轉(zhuǎn)移中所起的作用。蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析了腫瘤Exosome中的近1000種蛋白，發(fā)現(xiàn)Exosome中整合素（integrin）α6β4和α6β1在肺轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用；而Exosome中 integrin αvβ5 在肝轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。如果下調(diào)integrins α6β4和αvβ5，能分別阻止肺和肝轉(zhuǎn)移9。

圖4. Exosome與腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移

2.3促進腫瘤侵襲和擴散

Exosome促進腫瘤侵襲和擴散主要是通過EMT--上皮間質(zhì)化。Exosome在腫瘤的快速轉(zhuǎn)移也表現(xiàn)于其參與血管的形成。Exosome蛋白質(zhì)分析可以發(fā)現(xiàn)IL-8和VEGF（可參與新血管形成）表達量增多10。

（二）腫瘤液態(tài)活檢的最新技術(shù)---Exosome檢測平臺

1、目前臨床檢測Exosome方法

1.1超速離心法：是最常用的Exosome純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。

1.2密度梯度離心：通過密度梯度離心，樣品中的Exosome將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。

1.3超濾離心：利用不同截留相對分子質(zhì)量（MWCO）的超濾膜對樣品進行選擇性分離，便可獲得Exosome。

1.4磁珠免疫法：Exosome表面有其特異性標(biāo)記物（如CD63、CD9），用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與Exosome孵育，即可將Exosome吸附并分離出來。

1.5 PEG-base沉淀法：聚乙二醇（PEG）可與疏水性分子結(jié)合共沉淀，被用來沉淀Exosome。

1.6試劑盒提取：近年來已出現(xiàn)各種商業(yè)化的Exosome提取試劑盒，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。

6.1 ExosomeDiagnostics公司推出全球首個基于ExosomeRNA的液體活檢產(chǎn)品：ExoDx? Lung（ALK）。 ExoDx Lung（ALK）已在Exosome Diagnostics公司的CLIA認證實驗室得到驗證，是一種基于血漿Exosome的診斷產(chǎn)品，可靈敏、準(zhǔn)確、實時檢測非小細胞肺癌（NSCLC）患者的EML4-ALK突變。

6.2用于Exosome分析的集成磁電化學(xué)感受器（IMEX）將兩個正交的磁性選擇系統(tǒng)和電化學(xué)檢測系統(tǒng)結(jié)合。使用小磁珠捕獲Exosome，捕獲的Exosome通過電化學(xué)傳感器檢測。

6.3腫瘤Exosome的新一代測序分析：MD安德森癌癥中心的研究人員從胰膽管癌患者的體液中分離出Exosome。對exoDNA、exoRNA進行全基因組、外顯子組和轉(zhuǎn)錄組測序分析，表明Exosome中含有腫瘤細胞來源的DNA片段。

（三）Exosome RNA研究策略簡介

圖5. Exosome研究策略