背景
亞硝胺，或者更準確地說N-亞硝胺，是指任何含有亞硝基官能團的分子。1937年， Freund首次報道了2例職業接觸N-亞硝基二甲胺(NDMA，又稱二甲基亞硝胺)中毒案例，病人表現為中毒性肝損害[1]。1956年，英國兩位科學家發現，NDMA對實驗動物具有很強的致癌活性，自此亞硝胺開始受到人們廣泛關注[2]。NDMA和N-亞硝基二乙胺(NDEA)被世界衛生組織(WHO)國際癌癥研究機構判定為2A類致癌物[3]，ICH M7(R1)指南中明確指出該類物質具有較高致癌性(“關注隊列”)，屬于高誘變致癌物[4]。WHO在“Information Note Nitrosamine Impurities”中指出，盡管某些食物和飲用水含有亞硝胺，但藥物中不應存在這一物質，應予以嚴格控制[5]。
2018年6月，在血管緊張素II受體阻滯劑(ARB)纈沙坦中首次發現微量NDMA。2018年7月29日，中國國家藥品監督管理局就纈沙坦原料藥事件進行公告說明，對問題原料藥和涉及的制劑實施召回[6]。2018年10月20日，歐洲藥品管理局(EMA)更新了纈沙坦事件的進展：印度的兩家藥企生產的氯沙坦和厄貝沙坦藥物中，發現了NDEA，因此，歐盟將審查范圍擴展至所有沙坦類藥物[7,8]。
2019年2月8日，因纈沙坦原料藥含有可能致癌的雜質(NDMA和NDEA)，涉事藥企從日本召回4批次超26萬片降壓藥[9]。
目前的研究顯示，藥物中N-亞硝胺類雜質形成原因多樣、復雜，為確保藥物的安全性，ICH M7(R1)[4]列出5種主要亞硝胺雜質的臨時允許每日攝入量限值，各監管機構也采取相應措施，控制藥品中亞硝胺風險。
美國
美國食品藥品監督管理局(USFDA)于2019年9月13日發布安全警告，一些雷尼替丁藥物中含有NDMA。截止目前，已經召回特定企業的沙坦類、替丁類(雷尼替丁和尼扎替丁)藥物，USFDA要求5家企業主動召回二甲雙胍片，同時要求美國市場上所有的二甲雙胍生產企業評估各自產品中亞硝胺雜質的風險；根據最大日計量，USFDA列出了纈沙坦、氯沙坦、厄貝沙坦、阿齊沙坦、奧美沙坦、依普羅沙坦、坎地沙坦、替米沙坦共8種ARB中NDMA和NDEA的臨時限度，并公布部分檢測方法[10]，2020年9月1日，USFDA發布“人用藥中亞硝胺雜質控制指導原則”，為原料藥和制劑生產企業控制、評估產品中亞硝胺雜質風險提供指導，同時，把由于召回等原因可能導致的藥品供應短缺納入指導原則考慮范疇，并提供解決渠道。該指導原則在發布之日起生效[11]。
200年來，美國藥典委員會(USP)始終致力于公眾健康事業，其發布的《美國藥典-國家處方集》(USP-NF) 是經美國聯邦法律認可的法定藥品質量標準，由USFDA對美國境內藥品強制實施。亞硝胺事件后，USP成立了亞硝胺雜質研究專家志愿者小組，為保證工作中可以聽到不同的聲音，工作結果能夠體現廣泛的科學觀點，并確保各監管機構和公共標準的協調一致，小組成員由具有豐富和深厚經驗的人員組成，涵蓋監管(USFDA和EDQM)、藥品生產和雜質研究，小組對亞硝胺的成因、控制方法等開展嚴謹、科學、細致的基礎研究；為給企業提供更好的服務，為監管提供更強的技術支撐和保障，2020年6月，USP正式推出6種亞硝胺類雜質標準物質，以增強檢測過程的合規性和可溯源性、準確判定、科學評估藥物風險：
N-亞硝基二甲胺 (NDMA)
N-亞硝基二乙胺 (NDEA)
N-亞硝基二異丙胺 (NDIPA)
N-亞硝基二丁胺 (NDBA)
N-亞硝基乙基異丙基胺 (NEIPA)
N-亞硝基甲基氨基丁酸 (NMBA)
2020年7月，USP啟動了一系列針對遺傳毒性雜質和藥品質量的培訓活動(Genotoxic Impurities and Drug Quality--Lessons from the Nitrosamine Contamination Crisis)，以提高業界對遺傳毒性雜質的認知；2020年9月，USP發布通則“<1469>亞硝胺雜質”征求意見稿，主要包含如下內容：
1. 介紹了亞硝胺類雜質產生途徑、控制策略和限度推導、計算方法；根據亞硝胺雜質在藥物中微量存在的特點，提供樣品制備中應注意問題
2. 推薦了定量方法建立中線性范圍(Range)、準確度(Accuracy)、重現性(Repeatability)、中間精密度(Intermediate precision)和定量限(Limit of quantitation)等性能參數的可接受標準，并對專屬性(Specificity)等參數做出規定
3. 提供HPLC-HRMS,GC-MS,HPLC-MS/MS以及GC-MS/MS(triple-quad)四種參考定量方法
以上措施既考慮到微量物質測定方法建立中可能存在的儀器特性依賴，為業界提供充分的空間建立自己的測定方法，同時也幫助企業和研究機構在亞硝胺雜質的控制和評估層面更加有章可循，為監管和審查人員提供更為科學、全面的參考[12]。
歐洲
歐洲藥品管理局(EMA)首先通過召回等措施消除問題藥物的潛在危害，對可能含有亞硝胺雜質的沙坦類藥物進行審查，要求各問題藥品生產商開展自查、評估、必要時改變生產工藝，以盡可能減少亞硝胺雜質的產生。EMA為藥品生產企業提供了兩年的過渡期，規定過渡期內同一批次產品中亞硝胺單項雜質的含量應不得超過ICH M7中規定的臨時允許每日攝入量限值，同一批次產品中不得同時含有NDMA和NDEA 兩種雜質[13]。2020年6月，就上市許可持有人(MAH)如何避免在人用藥中產生亞硝胺類雜質提出指導意見[14]，不僅要求評估化學藥物中亞硝胺風險，還應評估生物藥物的亞硝胺風險。這一更新，首次將亞硝胺雜質的風險評估由化學藥品擴展到生物藥，同時提出在風險評估之外，對有潛在風險產品進行測試，用量化的結果證明藥物的安全性[15]。2020年8月6日， EMA發布了更新后的問答指南文件[16]，指南提供了有關亞硝胺雜質處理的建議并將化學API評估過渡期延長至 2021 年 3 月 31 日，取代了之前 2020 年 10 月 1 日。
2020年4月7日[17]，歐洲藥典(EP)發布“亞硝胺雜質分析方法(2.4.36)”征求意見稿，在征求意見稿中，EP提供三種分析流程，涵蓋7種亞硝胺雜質，主要針對含有四唑環結構的沙坦類藥品中N-亞硝胺的控制，涉及EP中5個各論-纈沙坦(Valsartan)，氯沙坦鉀(Losartan Potassium)，坎地沙坦酯(Candesartan Cilexetil)，厄貝沙坦(Irbesartan)和奧美沙坦酯(Olmesartan Medoxomil）。從2021年4月開始，含有四唑環結構的沙坦類藥品生產企業必須實施N-亞硝胺的控制策略，產品中不得包含可量化水平(相當于小于0.03 ppm)的兩種主要N-亞硝胺雜質:NDMA和NDEA。
中國
國家藥品監督管理局(NMPA)在亞硝胺事件后，在及時召回產品的同時，與EMA、USFDA等保持密切溝通和聯系，及時關注國際監管機構發布的風險評估公告和動態，同時組織專家開展風險評估。2019年11月，藥品審評中心發布“公開征求《關于在原料藥工藝中生成亞硝胺類化合物的風險警示》意見的通知”[18]，擬為原料藥研究和生產中存在的亞硝胺類化合物控制提供技術指導。在征求意見稿中，對已經上市的原料藥，除要求企業保持對產品質量的持續關注、必要時重新評估工藝的合理性、制定相關的控制策略和標準、開展補充研究、向監管部門提交申請變更外，明確要求:
“應選擇具有較高靈敏度的測試方法(如GC-MS、HPLC-MS等)對上述工藝路線分析得到的亞硝胺類化合物進行檢測和控制，并采用雜質對照品進行完整的方法學驗證，如系統適用性、專屬性、靈敏度和準確度等，保證亞硝胺類化合物能夠準確有效的檢出"
繼上述征求意見稿后，為了保證藥品的安全和質量可控，實現有效的風險控制，為注冊申請上市以及已上市化學藥品中亞硝胺雜質的研究和控制提供指導，2020年5月8日，國家藥品監督管理局藥品審評中心再次發布亞硝胺雜質相關指導原則《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則(試行)》[19]，指導原則分析了亞硝胺雜質可能產生的原因、提出了“避免為主、控制為輔”的策略，對這類雜質的檢測方法，明確強調方法的靈敏度要與雜質限度相匹配，在此基礎上，與《關于在原料藥工藝中生成亞硝胺類化合物的風險警示》完全一致，再次明確要求：
“采用雜質對照品進行完整的方法學驗證，保證亞硝胺類化合物能夠準確有效的檢出”。
《中國藥典》2020年版四部[20]新增“遺傳毒性雜質控制指導原則(附錄9306)”，提供可用于藥物遺傳毒性雜質的鑒別、分類、定性和控制的可行性方法，以控制藥物中遺傳毒性雜質潛在的致癌風險，為上市藥物的生產、流通、臨床應用和監管提供參考。《中國藥典》2020年版二部[21]各論中，對涉及的纈沙坦等6個沙坦類品種，均增訂【生產要求】項，要求企業對生產工藝等進行評估以確定形成遺傳毒性雜質的可能性，必要時，應采用適宜的分析方法對產品進行分析，以確認雜質含量符合我國藥品監管部門相關指導原則或ICH M7指導原則要求。隨著《中國藥典》2020年版的正式實施，上市產品均應符合新版中國藥典的規定，確保上市藥品的安全性。
結語
遺傳毒性雜質是藥品研究、質量控制過程中無法回避的課題，亞硝胺雜質作為遺傳毒性雜質的一大類，人們對它的了解、認知都在不斷深入。美國藥典委員會作為公共標準的制定機構，將與全球監管、藥典機構共同努力，致力于解決藥物中亞硝胺雜質問題，為公眾提供高品質的、安全的藥品。
參考文獻
1.H.A. Freund. Clinical Manifestations and Studies in Parenchymatous Hepatitis, Annals of Internal Medicine,1937(10)8,1144-1155
2.Advance in Agronomy, Academic Press,2013-01-08, P.159
3.http://samr.cfda.gov.cn/WS01/CL1991/215896.html
4.https://database.ich.org/sites/default/files/M7_R1_Guideline.pdf
5.https://www.who.int/medicines/publications/drugalerts/InformationNote_Nitrosamine-impurities/en/
6.https://www.nmpa.gov.cn/yaowen/ypjgyw/20180729174001758.html
7.https://www.ema.europa.eu/en/news/valsartan-review-impurities-extended-other-sartan-medicines
8.https://www.ema.europa.eu/en/news/eu-authorities-take-further-action-ongoing-review-sartans-zheijiang-huahai-placed-under-increased
9.https://www.fiercepharma.com/manufacturing/pfizer-japan-finds-impurities-its-valsartan-drugs-made-by-mylan
10.https://www.fda.gov/consumers/consumer-updates/what-know-and-do-about-possible-nitrosamines-your-medication
11.https://www.fda.gov/media/141720/download
12.http://www.usp.org
13.https://www.ema.europa.eu/en/news/sartan-medicines-companies-review-manufacturing-processes-avoid-presence-nitrosamine-impurities
14.https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/post-authorisation/referral-procedures/nitrosamine-impurities#guidance-for-marketing-authorisation-holders-section
15.https://www.ema.europa.eu/en/human-regulatory/post-authorisation/referral-procedures/nitrosamine-impurities
16.https://www.ema.europa.eu/en/documents/referral/nitrosamines-emea-h-a53-1490-questions-answers-marketing-authorisation-holders/applicants-chmp-opinion-article-53-regulation-ec-no-726/2004-referral-nitrosamine-impurities-human-medicinal-products_en.pdf
17.https://www.edqm.eu/en/news/ph-eur-launches-public-consultation-new-general-chapter-analysis-n-nitrosamines
18.http://www.cde.org.cn/news.do?method=largeInfo&id=1b252859e588d725
19.http://www.cde.org.cn/news.do?method=largeInfo&id=b996c96fd7e72742
20.《中國藥典》2020年版四部
21.《中國藥典》2020年版二部
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