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       如今全球10大暢銷藥大部分都是利用哺乳動(dòng)物與微生物細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)，利用細(xì)胞制造生物藥與疫苗當(dāng)前已在行業(yè)中非常普遍。現(xiàn)在一旦出現(xiàn)一個(gè)比較著名的，而且不斷在擴(kuò)大的新型生物制品產(chǎn)品線⁽¹⁾ ，它便要面臨著與日俱增的成本降低以及和生物仿制藥競(jìng)爭(zhēng)的雙重壓力，這就意味著許多的生物制藥公司需要努力尋找新的方法來提高研發(fā)實(shí)驗(yàn)室的工作效率，以確保上游工藝的效率和穩(wěn)定性。

對(duì)這些公司而言，其中一個(gè)主要挑戰(zhàn)是將細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝高昂成本降低，以確保相關(guān)產(chǎn)品用于治療的商業(yè)可行性。例如，抗體治療中需要使用大劑量(6~12g)單克隆抗體(MAb)來獲得臨床療效，這意味著患者每年需要花費(fèi)數(shù)萬美元用于此類治療。目前，使用貝伐單抗和西妥昔單抗治療大腸癌，每個(gè)療程(8周)⁽²⁾需要花費(fèi)2~3萬美元，是同類小分子療法的60倍之多。
 

 圖1 全自動(dòng)ambr 250生物反應(yīng)器應(yīng)用于發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)
 

預(yù)防性疫苗的生產(chǎn)也極具挑戰(zhàn)性，雖然當(dāng)前此類藥物的全球銷售額與單抗的相比，還相對(duì)較小。生產(chǎn)商需要快速的應(yīng)對(duì)出現(xiàn)的市場(chǎng)需求，提供優(yōu)質(zhì)價(jià)廉的預(yù)防性疫苗，既能夠應(yīng)對(duì)季節(jié)性流感，又能夠應(yīng)對(duì)大面積流行感冒威脅。成本和時(shí)間限制促使生物制藥公司急切需求能夠進(jìn)行快速開發(fā)優(yōu)化并放大生產(chǎn)工藝的策略。
 

越來越扁平化的收入和高開發(fā)成本使得產(chǎn)品上市時(shí)間對(duì)于公司的盈利能力來說至關(guān)重要。因此，盡早生產(chǎn)出具有理想品質(zhì)的產(chǎn)品是所有制藥企業(yè)的迫切所需。所以對(duì)于生物制藥而言，快速、高效的工藝開發(fā)是成功商業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)⁽³⁾。
 

表1 2

對(duì)于生物制品生產(chǎn)企業(yè)而言，挑戰(zhàn)之一便是大量新法規(guī)要求的不斷推出。在一種藥物或疫苗成功上市之前，生產(chǎn)商必須要證明他們的產(chǎn)品符合所有有關(guān)高品質(zhì)、安全性以及有效性的法規(guī)要求。部分法規(guī)是為了支持監(jiān)管義務(wù)，而要求提供工藝開發(fā)過程中獲得堅(jiān)實(shí)的科學(xué)證據(jù)。因此，在工藝開發(fā)和優(yōu)化過程中，有必要進(jìn)行多變量分析與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，開展大量的工藝研究實(shí)驗(yàn)，而這個(gè)過程耗時(shí)昂貴且需要大量人力。
 

傳統(tǒng)的疫苗生產(chǎn)方法，如搖瓶、臺(tái)式生物反應(yīng)器或轉(zhuǎn)瓶均已被應(yīng)用于工藝開發(fā)。但是這些方法需要大量人力，容易出現(xiàn)人為錯(cuò)誤。并且需要大面積的實(shí)驗(yàn)室和較高的成本。
 

一個(gè)清晰易于理解的生物藥生產(chǎn)工藝最好是通過應(yīng)用復(fù)合的DoE(實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì))方法開發(fā)出來的。這樣的方法具有非常高的試驗(yàn)容量⁽⁴⁾。但應(yīng)用此類方法必須要對(duì)與工藝全面了解，包括培養(yǎng)基成份和所有工藝參數(shù)(以及更改參數(shù)后所造成的影響)等，因?yàn)檫@些參數(shù)不僅會(huì)改變產(chǎn)品效價(jià)，還將改變產(chǎn)品的質(zhì)量屬性。
 

由于傳統(tǒng)工藝開發(fā)方法與生俱來的限制，開發(fā)過程中包含了大量需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)誤，導(dǎo)致許多生物工藝的開發(fā)成本不斷攀升，讓人望而卻步。
 

穩(wěn)定并快速的工藝開發(fā)過程只有在一個(gè)兼容一次性技術(shù)且易于搭建的平行放大平臺(tái)上進(jìn)行自動(dòng)化操作才可實(shí)現(xiàn)。因此，有必要摒棄傳統(tǒng)的生物工藝開發(fā)方法，轉(zhuǎn)而利用全新高通量工藝開發(fā)和優(yōu)化平臺(tái)。該類型的技術(shù)平臺(tái)應(yīng)該具備以下三個(gè)主要特點(diǎn)：
 

• 小型化，以低成本快速獲得海量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù);

• 自動(dòng)化，以進(jìn)行大量的重復(fù)性精準(zhǔn)操作;

• 并行性，以更廣的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)域(條件)，加深對(duì)工藝細(xì)節(jié)的理解。

此文中展示了一項(xiàng)自動(dòng)化的微型生物反應(yīng)器技術(shù)，該技術(shù)能夠進(jìn)行微生物發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)的高通量工藝開發(fā)和優(yōu)化。此外，本研究還將通過分析分別收集于自動(dòng)化生物反應(yīng)器、實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器和中試生物反應(yīng)器的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，來展示這項(xiàng)技術(shù)的適用性。
 

材料與方法

微型生物反應(yīng)器：選擇用于放大比較的微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)：ambr 250自動(dòng)化生物反應(yīng)器(來自TAP生物系統(tǒng)公司，賽多利斯集團(tuán)成員之一)。該系統(tǒng)由三部分組成：易于連接的250mL生物反應(yīng)器(有微生物和哺乳動(dòng)物兩種配置可供選擇)，自動(dòng)化工作站和軟件(圖1。
 

該平臺(tái)提供更大的培養(yǎng)體積(相對(duì)于Ambr15而言)，連續(xù)的料液泵送，及每個(gè)反應(yīng)罐的參數(shù)獨(dú)立控制功能。這些特征使得系統(tǒng)能夠提供更頻繁的補(bǔ)料和供更廣泛分析測(cè)試的大體積取樣。培養(yǎng)條件與流加補(bǔ)料并行調(diào)控參數(shù)的結(jié)合使得Ambr 250成為一款能夠支持質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)理念的比例縮小反應(yīng)器模型。
 

Ambr 250工作站屬于典型的Ⅱ級(jí)(層流式)生物安全柜，設(shè)計(jì)安裝12或24個(gè)生物反應(yīng)器。兩款的配置均包括一個(gè)自動(dòng)液體單元，用于生物反應(yīng)器、樣品床或培養(yǎng)基瓶之間的液體傳輸，還可用于自動(dòng)取樣，接種甚至是培養(yǎng)基制備。
 

概念驗(yàn)證

微生物細(xì)胞生產(chǎn)工藝的放大：為了證明ambr 250系統(tǒng)應(yīng)用于微生物培養(yǎng)工藝開發(fā)和比例縮小反應(yīng)器模型的有效性，需要對(duì)分別在微型生物反應(yīng)器，臺(tái)式發(fā)酵罐以及中試規(guī)模的發(fā)酵罐中的獲得的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。為此，選擇重組表達(dá)治療功效蛋白的大腸桿菌作為模型生物。
 

將克隆細(xì)胞培養(yǎng)于ambr 250系統(tǒng)中，該系統(tǒng)使用具有雙檔20mm直徑拉什頓葉輪攪拌的一次性生物反應(yīng)器。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中分別用15L臺(tái)式發(fā)酵罐和150L中試規(guī)模發(fā)酵罐培養(yǎng)相同的克隆菌株。

表3 4

所有容器中均按照2-5%的比例接種OD 600值在1和5之間的種子液。采用合成培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72小時(shí)，pH條件控制為7.0±0.03，溶氧(DO)控制為30%，攪拌輸入功率為5.33x102至1.43x104 W/ m3。每12小時(shí)取樣分析一次，使用SpectraMAX plus 384分光光度計(jì)(來自Molecular Devices)測(cè)量細(xì)胞的OD 600值。

在臺(tái)式和中試發(fā)酵罐中，二氧化碳釋放速率(CER)采用Prima PRO過程質(zhì)譜儀(來自Thermo Scientific)進(jìn)行測(cè)定。在ambr 250系統(tǒng)中，通過內(nèi)置的尾氣分析儀測(cè)定CER，每一臺(tái)生物反應(yīng)器都有獨(dú)立的尾氣分析儀。
 

哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)工藝的放大：對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)而言，為了證明ambr 250生物反應(yīng)器系統(tǒng)是一款適合的早期工藝開發(fā)模型，必須要將其培養(yǎng)結(jié)果與臺(tái)式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。為了說明這一點(diǎn)，選擇重組表達(dá)治療功效蛋白的CHO細(xì)胞作為模型生物。將細(xì)胞分別培養(yǎng)于一次性的ambr250反應(yīng)器和3-L臺(tái)式生物反應(yīng)器中。采用專利的合成培養(yǎng)基， 37℃培養(yǎng)16天，pH控制條件為7.0±0.3，溶氧(DO)控制條件為40%，攪拌葉尖轉(zhuǎn)速為0.25m/s。初始細(xì)胞以1x106個(gè)活細(xì)胞/ mL的密度接種，每24小時(shí)取樣一次，用ViCell細(xì)胞活力分析儀(來自Beckman Coulter公司)進(jìn)行樣品分析。從接種第2天起每間隔24小時(shí)檢測(cè)滴度，使用Biacore400分析儀(來自GE Healthcare公司)進(jìn)行測(cè)定。
 

圖2  全自動(dòng)ambr 250生物反應(yīng)器最多可控制24個(gè)250mL的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)
 

小結(jié)

可放大性：大腸桿菌菌株在ambr 250生物反應(yīng)器和15L及150L發(fā)酵罐中培養(yǎng)后的細(xì)胞密度和二氧化碳釋放速率(CER)值表現(xiàn)出非常相似的結(jié)果(圖1和圖2)，15L和150L容器的OD 600值分別在ambr 250數(shù)據(jù)的兩端，CER峰則出現(xiàn)在同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)。這些結(jié)果表明，ambr 250系統(tǒng)是一套適用于工藝開發(fā)與優(yōu)化的比例縮小反應(yīng)器模型。
 

CHO細(xì)胞在ambr 250系統(tǒng)和3L生物反應(yīng)器中所展現(xiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)能力與產(chǎn)物滴度水平均顯示出良好的可比性(圖3和圖4)，比如最大細(xì)胞活力，細(xì)胞密度以及產(chǎn)物最高效價(jià)在同一時(shí)間點(diǎn)達(dá)到。而且ambr 250系統(tǒng)比臺(tái)式生物反應(yīng)器具有更好的結(jié)果一致性。這表明利用ambr 250生物反應(yīng)器系統(tǒng)開發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝具有良好的可重復(fù)性。
 

本研究中我們提出了一種并行的自動(dòng)攪拌式微型生物反應(yīng)器技術(shù)，可以用于微生物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝的快速開發(fā)優(yōu)化。結(jié)果表明， ambr 250生物反應(yīng)器系統(tǒng)可以復(fù)現(xiàn)更大規(guī)模反應(yīng)器(實(shí)驗(yàn)室和中試規(guī)模)中哺乳動(dòng)物和微生物培養(yǎng)工藝，并獲得一致的結(jié)果(細(xì)胞密度和效價(jià))。這與已發(fā)表的CHO細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)數(shù)據(jù)一致，表明自動(dòng)化微型生物反應(yīng)器可以模擬臺(tái)式生物反應(yīng)器(5,6)，并且在關(guān)鍵參數(shù)(如細(xì)胞生長(zhǎng)和效價(jià))上，兩者具有高度可比性。
 

Ambr 250 生物反應(yīng)器系統(tǒng)可以自動(dòng)并行操作多達(dá)24個(gè)生物反應(yīng)器，所以DoE實(shí)驗(yàn)可以在一輪實(shí)驗(yàn)中完成。這意味著多參數(shù)變量的研究不再受限于臺(tái)式生物反應(yīng)器數(shù)量、操作時(shí)間和設(shè)備狀態(tài)等多方面因素。Ambr 250生物反應(yīng)器系統(tǒng)可以替代搖瓶和傳統(tǒng)的臺(tái)式生物反應(yīng)器模型用于工藝開發(fā)和優(yōu)化。這將減少人工操作強(qiáng)度，從而極大地節(jié)省了時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施，并且降低培養(yǎng)基的消耗。
 

該平臺(tái)自動(dòng)化程度高，易于建立，且耗材一次性使用，減少了輔助時(shí)間，細(xì)胞培養(yǎng)體積也小，因此科學(xué)家可以利用它專注于設(shè)計(jì)并執(zhí)行高通量實(shí)驗(yàn)，快速獲取準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。Ambr250系統(tǒng)可以幫助開發(fā)者顯著減少重復(fù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)，節(jié)省時(shí)間，是生物制藥工藝開發(fā)與優(yōu)化高效并經(jīng)濟(jì)的工具。

應(yīng)用ambr 250生物反應(yīng)器系統(tǒng)還能提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，將復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析應(yīng)用于哺乳動(dòng)物與微生物細(xì)胞工藝開發(fā)中。這將顯著縮短早期開發(fā)時(shí)間并降低開發(fā)成本，縮短技術(shù)轉(zhuǎn)讓與產(chǎn)品上市時(shí)間，最終得以向市場(chǎng)提供更加廉價(jià)的生物藥物和疫苗。
 

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