成人午夜又粗又硬又长_鲁一鲁AV2019在线_欧美深深色噜噜狠狠yyy_www.91色.com_色影音先锋av资源网_特级做A爰片久久毛片A片喷水_99精品无人区乱码1区2区3区_国产人妻久久精品一区_欧美午夜精品久久久久久浪潮_av免费无码天堂在线_蜜桃色欲AV久久无码精品软件_日美一级毛片_久久久久久久久性潮_国产乱对白精彩_日韩精品免费一区二区_亚洲欧美精品在线_无码国产69精品久久久久_开心五月综合激情综合五月_干一夜综合_亚洲中文有码字幕日本

 FMD對運動協調、記憶和神經生成的影響

衰老伴隨著運動和認知功能的下降（Lynch,2004）。為了評估運動協調和平衡，我們測試了小鼠對加速旋轉的表現（Shiotsuki等，2010）。23月齡小鼠，每2周中有1周實施FMD（FMD-RF，FMD測試1周后，恢復正常日糧糧飼喂），在旋轉輪上比對照組小鼠停留的時間更久（圖3A）。我們還在隨后試驗期間，通過檢查性能的改善，對運動學習能力作了評估。FMD-RF組小鼠，一直比自由采食日糧組小鼠更好地停留在加速桿上面，雖然兩組的學習速度是相似的（測試2-5；圖3B）。小鼠的體重與最佳旋轉表現是呈負相關的（皮爾遜相關系數r=-0.46；P=0.005）。當體重恰當時，旋轉表現的改善不再顯著（P=0.34，數據未列），這表明FMD小鼠得益于減肥。

為了檢測禁食模擬日糧（FMD）對認知功能的影響，我們對23月齡小鼠進行了記憶測試（Beninger等，1986）（圖3C）。FMD組小鼠與對照組小鼠相比，增強了自發交替改變行為的情況，但其前肢伸進容器的總次數沒有差異（活動性測定）（圖S3A）。使用新目標測試，來評估短期認知功能和程序依賴性記憶（圖3D和3E）（bernabeu等，1995）。FMD小鼠（RI=0.06）與對照組小鼠（RI=0.52）相比，有較高的識別指數（P﹤0.01，圖3D）。FMD小鼠對新目標的探索時間有所增加，然而，總的探索時間保持相同（FMD-RF 13.4±0.9對CTRL 13.6±0.9），這表明短期認知功能增強，而總的活動性沒有增強（圖3E；圖S3B）。

作為衡量長期記憶的方法，我們使用巴恩斯迷宮來測量小鼠的空間學習和記憶能力：一種海馬相關性認知任務，需要通過對視覺線索的學習和記憶的空間參照系記憶，來定位獨特的逃逸箱路徑（圖3F-3K）（Barnes,1988）。7天訓練期間，FMD組小鼠在有關錯誤、偏差、等待和成功率方面，優于對照組（圖3F-3I）。在第14天，測試小鼠的記憶保持情況，FMD組表現了更好的記憶力，表明其記憶偏差減少。對照日糧組小鼠的記憶偏差，在14天時相似于第1天，表明這些小鼠經過7天的學習，仍未能記住逃逸箱的定位。觀察到了FMD組小鼠搜索策略的轉變，包括在空間策略方面，從隨機到連續搜索的轉變，但對照日糧組在3-4天以后仍未有改進。總之，行為測試表明，周期性FMD改善了老年小鼠的運動學習以及海馬相關的短期和長期的記憶。

成年時的神經生成，在學習和記憶中起著重要的作用（Clelland等，2009；Deng等，2010；Mattson,2012）。為了確定模擬節食日糧是否影響神經生成，我們測定了8周齡、12周齡、6月齡和24月齡對照組小鼠的顆粒細胞下層中溴脫氧尿苷（BrdU）的摻入（圖4B）。與之前的報道相似，我們觀察到BrdU在齒狀回中的摻入，有一個年齡相關性下降（Lee等，2012c）（圖4B）。為了評估FMD組的認知改善是否與神經再生有關，我們測定了海馬齒狀回顆粒細胞下層中的DCX+未成熟神經元的增殖指數。BrdU+或BrdU+DCX+雙標記表明，FMD組中未成熟神經元的增殖，比對照組有了增加（圖4C-4E）。為了研究FMD誘導新神經生成的機制，飼喂的6月齡小鼠與FMD單次的8周齡小鼠相比，齒狀回的細胞增殖減少了50%以上（圖4B）。FMD72小時以后，我們觀察到循環中的和海馬中的IGF-1（圖4F）減少，不過，海馬體齒狀回區中IGF-1受體mRNA則增加了(圖4G)。FMD小鼠充實的齒狀回樣本的微解剖，顯示蛋白激酶A（PKA）活性大幅降低和Neuro D1表達具有2倍的誘導力（圖4I），Neuro D1是一個對神經的保護和分化有重要作用的轉錄因子（Gao等，2009）。同樣，一個周期的FMD增加了CD-1小鼠的放射狀膠質細胞（Ⅰ型）、非放射狀前體（Ⅱ型）神經干細胞（圖S4B，S4C，S4F和S4G）、未成熟神經元（圖S4D和S4I-S4Q）和樹突狀覆蓋區（圖S4E和S4H）。

在兩個遺傳背景中的這些結果，表明FMD促進了成年小鼠的神經生成。值得注意的是，FMD期間大腦沒有經歷可以測量到的重量減少，表明在恢復飼喂后，神經的再生也不依賴于器官體積的增加而獨立地發生。因此，我們假設，恢復飼喂以后，循環因子例如IGF-1水平和PKA信號降低的改變，可誘導有利于再生的變化，依賴性地或獨立性地發生主要細胞的增殖，這與先前在骨髓和血液細胞中的發現是相一致的（Cheng等，2014）。最有可能的是，再飼喂后，IGF-1和PKA的增加，也有助于增殖和再生，這些蛋白的高水平和低水平二者可促進再生可能性的提高，這取決于它們表達的時間。或者，FMD可能提高了新分化神經元的存活，如在恢復飼喂日小鼠齒狀回中所觀察到的（Lee等，2002；Mattson 等，2001）。于FMD組中觀察到的認知能力的改善，可能是受到依賴于Neuro D1調節的PKA/CREB（環磷腺苷效應元件結合蛋白）的影響（Cho等；Sharma等，1999），這被認為提高了海馬祖細胞神經元的存活和分化（Roybon等，2009），提高了新神經元的功能集成和減輕了阿爾茨海默氏病小鼠模型的記憶缺陷程度（Richetin等，2015）。

FMD和壽命

對照組小鼠的平均壽命為25.5個月（圖5A），FMD組小鼠的壽命延長到28.3個月（延長了11%）（P﹤0.01）。FMD組小鼠在75%生存點時，壽命的延長效應達18%，但在25%生存點時的延長作用只有7.6%，而在最長壽命點時則沒有效果，這表明在很老年齡段時，4天的FMD可能在某些方面是有益的，而在其他方面是有害的。進一步的分析表明，很老年齡段許多小鼠的死亡，發生在FMD周期完成時或完成后的短時間內（3天內）（圖5E；用星號標出的）。這些結果表明，周期性FMD對壽命和一生的影響，至少對非常老的小鼠，一個較少嚴格（3天對4天）低能量和低蛋白的日糧，可能會更好地提供有益的作用，而把營養不良降到最低程度，這與我們最近在小鼠和中老年及很老的人中的研究證明，攝入高蛋白對健康/死亡率，會起相反作用的結果是相一致的（Levine等，2014）。

周期性FMD先導隨機臨床試驗

衰老和疾病的標志物

為了評估周期性低蛋白和低能量FMD對人體的可行性和潛在的影響，我們進行了一項普通健康成年人的先導臨床試驗。人FMD中的主要和微量的營養組分和水平，是根據它們在小鼠FMD中，降低IGF-1提升IGFBP-1、降低血糖提升酮體、使營養分盡可能達到最大值、和使不良影響降到最小值（圖S1）的作用來選擇的。人類FMD的配制，需考慮其可用性（如人對規定的飲食方案，具有高度的可遵循性），因此，設計了每個月持續5天的，由9%-10%蛋白質、34%-47%碳水化合物和44%-56%脂肪組成，可提供34%-54%常規攝入能量的FMD。連續地進行3個月的試驗。受試者被隨機地分配到FMD組或對照組。對照組，仍保持他們原來的正常飲食。FMD組，在FMD時期后，重新食用他們正常的日糧，并請他們對正常的飲食和鍛煉習慣不要有任何的改變。5%的受試者，由于未能遵循試驗的飲食方案，而從試驗中剔除。14%的受試者，由于非FMD相關的原因，而退出了研究（如工作和旅行相關程序的安排問題）。我們提交的這個先導隨機臨床試驗結果，包括一組成功完成3輪FMD的19個受試者，和19個隨機對照受試者保持他們正常飲食的數據。對照組包括9名女性（47.4%）和10名男性（52.6%），平均年齡分別為35.4±5.5歲和38.0±1.7歲。FMD組包括7名女性（36.8%）和12名男性（63.2%），平均年齡分別為41.8±4.9歲和42.5±3.5歲（圖S5A和S5B）。對照組的年齡幅度19.8-67.6歲，FMD組的年齡幅度27.6-70歲。受試者的種族分別為白人58%、西班牙裔18.5%、亞裔18.5%和黑人5%（圖S5C）。受試者通過基礎檢查來進行評估（圖6A）。FMD組在第一輪FMD結束和重新食用正常食物之前隨機進行檢查，以及在5-8天正常飲食之后再接著進行第3輪FMD之間實施檢查（FMD-RF，圖6A）。基礎檢查和FMD-RF檢查之間/測定點的平均時間為75.2±2.7天，而對照組的基線檢查和最后檢查之間的測定點平均時間為74.5±6天。對所有3個FMD周期中的受試者，根據副反應的常用標準術語，由他們自己報告副反應情況（圖S5D）。首輪FMD完成后，比那些第2和第3輪FMD期間的副反應更高。然而，報告的平均副反應嚴重性是非常的低，在“輕度”以下（以1-5級計，﹤1級）。

FMD受試者中，在重新食用正常日糧后，接著進入第3個FMD周期之間，測定的空腹血糖水平比基線水平降低了11.3%±2.3%（P﹤0.001；FMD），維持在5.9%±2.1%（P﹤0.05；圖6B）。血清酮體在FMD養生法結束時增加了3.7倍（P﹤0.001），正常進食后則恢復到基線水平（圖6C）。循環IGF-1在FMD時結束降低～24%（P﹤0.001），在恢復正常飲食后仍保持降低～15%（P﹤0.01；圖6D）。IGFBP（鼠胰島素生長因子結合蛋白）在FMD方案結束時增加了1.5倍（P﹤0.01），而在正常進食后則恢復到基線水平（圖6E）。這些結果表明，FMD組小鼠有高度的依從性，除了在FMD日糧箱供給它們時，一般地不會采食。

體重、腹脂、去脂體重和代謝標志物

  FMD降低了小鼠的體重和減少了內臟脂肪。我們通過測定小鼠體重、腹脂和去脂體重，來研究FMD是否能夠在人體中也有類似的作用。FMD導致了體重減少3%（3.1%﹤±0.3%；P﹤0.001；圖6F），到完成研究時，體重仍保持在較低的水平（P﹤0.01；圖6F）。用雙能X線吸光測定法測定，軀體脂肪的百分比，在3輪FMD和正常進食1周后，呈現下降趨勢（P=0.1）（圖6G），而在3輪FMD完成后，經與體重校正過的相對去脂體重則增加了，這表明體重損失的大部分是脂肪。FMD對骨盆骨的礦物質密度沒有影響（圖S5D）。

一組完整代謝數據（圖S5E-S5L）表明，在恢復正常日糧后，除了膽紅素和堿性磷酸酶含量較低外，沒有因FMD而存在持久的代謝改變。總之，據受試者自己報告的常見標準術語副反應事件，提供的這些最初的證據表明，周期性FMD總的來說是安全的，只引起脂肪的減少，而不減少去脂體重。

心血管病風險因子

FMD減少了小鼠中與炎癥有關疾病的發生（圖2）。人體中血清C反應蛋白（CRP）的水平，是一個炎癥和心血管疾病風險因子的標志物。FMD受試者的CRP平均基線水平是1.45±0.45mg/L(圖 6I),類似于對照組水平（1.29±0.5mg/L）,這表明存在著一個平均的心血管疾病輕度風險。通過周期性FMD，降低了CRP水平。19個FMD受試者中的8個，CRP水平在基線之上（分別高于1.0和3.0mg/L），處在中度和高度的心血管疾病風險范圍內。19個FMD受試者中的7個，經過3輪FMD后，CRP水平回復到正常范圍（低于1.0mg/L）(圖6I)。11個FMD受試者的CRP水平低于基線1.0mg/L,在試驗完成時觀察到CRP濃度沒有改變。這些結果表明，周期性FMD促進了抗炎作用和至少降低了一個CVD（心血管疾病）的風險因子。

再生性標志物

周期性FMD小鼠，促進了間充質干細胞和祖細胞的增加（MSPC；圖2）。我們因此分析了FMD受試者外周血液中的lin-CD184-MSPCs(圖 6J)。隨著再度飼喂以后，FMD外周血中的MSPC百分比，回復到基線水平（0.27±0.2），雖然沒有顯著性，但單核細胞亞群在FMD終點時達到1.06±0.6，顯示了比基線水平增加0.15±0.1，呈現了一個增加的趨勢（P=0.1）。這將需要有一個較大的隨機試驗來確定，人體中的特定干細胞亞群的數量，事實上是否由于FMD得到了升高。

簡單地說，這項研究表明，周期性FMD的誘導使許多組織，包括小鼠中的內分泌、免疫和神經系統等許多組織和人體疾病及再生組織，獲得了益處和/或復壯的效果。雖然，這些臨床試驗的結果，需要由更大型的隨機臨床試驗來確證，不過，周期性FMD對衰老、癌癥、糖尿病和心血管疾病的生物標志物/風險因子的影響，加上受試者對FMD有很高的依從性和安全性，表明這種周期性節食策略，對有效地延長人類的壽命和提高健康水平，是有高度潛能的。因為，持續時間較長的FMDs，例如，本研究中的一個試驗是強力和廣譜的，所以，它們應該只有在醫學監管之下才可使用。

實驗材料和方法

受試者

實驗設計和報告的準備，遵循CONSORT標準（隨機對照臨床試驗報告規范）。可用的數據取自于已經遞交的先導試驗。遵循南加州大學倫理審查委員會批準的協議，根據其規定的標準，包括（總體健康的成年志愿者，年齡18-70歲，體重指數BMI 18.5及以上）和包括（任何重大疾病和慢性病、精神疾病、藥物依賴、激素替代治療[脫氫表雄酮、雌激素、甲狀腺劑、睪酮]、女性的懷孕或哺乳、特殊飲食需求或食物過敏、酒精依賴）等，進行招聘受試者。全部受試者簽具知情同意書，而且不向受試者提供經濟補償。受試者在經過基線檢查后，基于年齡和性別的統計處理，分配于對照組（CTRL，n=19）和實驗日糧組（FMD，n=19）。CTRL組繼續食用正常的食物，受試登記后，回家，再跟蹤檢查3個月。FMD組受試者食用提供的實驗日糧連續5天，接著25天食用正常食物，共進行3輪循環。在全部3個FMD循環期間，由受試者按照副反應常用標準術語，報告自己所出現的副反應。FMD組，在第1個FMD周期結束和恢復食用正常食物之前，以及第3個FMD周期結束，接著正常飲食5-8天（FMD-RF）以后，進行各項檢查。預先確定結果的測定，包括堅持飲食方案和研究持續期，及完成研究后生理標志物的評估。檢查包括身高、連衣體重，使用雙能X線吸光測定法（DEXA）測定身體的成分（包括全身脂肪、軟瘦肉組織和骨礦物質含量）、以及通過靜脈穿剌抽取血液。所有的數據，由南加州大學糖尿病和肥胖癥研究所采集。完整的代謝組，由加州大學凱克醫學中心臨床實驗室，在血液抽出后立即測定。數據分析，根據研究設計進行。當研究完成時，完整的數據將可在其他的地方利用。

人的日糧

人的禁食模擬日糧（FMD）方案，是一個植物為基礎的日糧方案，設計達到禁食樣效果，同時提供微量營養（維生素、礦物質等）食物，并把禁食的折磨降到最小。它的專利組成，以蔬菜為基礎的湯、能量條、能量飲料、小片零食、甘菊花茶和一張蔬菜補充配方表（表S4）。人FMD 5天實施方案：第1天的日糧供應能量～1090千卡（10%蛋白質、56%脂肪、34%碳水化合物），第2-5天的日糧由相同成分構成，但只提供725千卡（9蛋白質、44%脂肪、47%碳水化合物）能量。

動物

所有動物方案，均經南加州大學動物管理和使用倫理委員會批準。實驗設計和報告準備遵循小鼠工作的ARRIVE（動物研究：體內實驗報告）標準執行。110只9月齡雌性C57BI/6（查爾斯河實驗室）小鼠，由退休人員飼養于無病原的環境中，放置于清潔的鞋匣樣籠子里，每籠3只小鼠，恒溫恒濕、，周期性12小時光照12小時黑暗，以及自由飲水。16月齡的小鼠，被隨機地以免咬斗而按籠分配到自由采食對照組（CTRL）和禁食模擬日糧組（FMD）。小鼠體重，常規地每兩周在開始新FMD周期之前測定一次。每天測定FMD和CTRL各9只小鼠的安全性評估，并記錄FMD期間的體重變化情況。測定每天的采食量。小鼠一旦出現進行性皮炎時，即用三聯抗生素軟膏（富熱拉制藥公司）治療，如果病情惡化則予以安樂死。為了減少主觀性偏差，在任何實驗不久前，小鼠被短期地隨機分配（使用Graphpad軟件的在線隨機數據計算器）到任一行為和生理學的評估中。顯示衰弱和/或疾病跡象的小鼠，均不納入任何實驗中。死亡或廢棄的小鼠即進行尸體剖檢，并把所有異常種類病變遞交一位病理學家評估。73只小鼠進行了尸體解剖檢查；2只小鼠（每組各1只）因同類相食而未能尸檢。我們還用相同的方法，利用品系匹配更年青小鼠，來確認風險因子的年齡相關性變化。此外，6月齡雌性CD-1小鼠（查爾斯實驗室）被用于測定成年鼠神經生成的增補實驗。

小鼠日糧

小鼠自由采食經幅照過的TD.7912嚙齒動物食品（哈倫泰克拉德公司），每克含15.69千焦消化能（3.92KJ/g 動物蛋白質，9.1KJ/g碳水化合物，2.6KJ/g 脂肪）。

FMD經營養成分的檢查，確認使其營養成分在試驗期間的低能量消耗（Brandhorst等，2013）。FMD設計有兩種不同組成成分，按照各自的順序分為第1天的日糧和第2-4天的日糧。第1天的日糧由混合的多種低能量湯粉、蔬菜混合粉、特級初榨橄欖油和必需脂肪酸組成；第2-4天日糧由低能量湯粉和甘油組成。兩種配方日糧用水凝膠（清潔的水）使它們達到粘結，以致可把這種食物放入籠中的飼喂器。第1天的日糧含有7.67KJ/g能量（提供正常日糧攝入能量的50%；0.46KJ/g蛋白質，2.2KJ/g 碳水化合物，5.0KJ/g脂肪）；第2-4天日糧是相同的，含有1.48KJ/g 能量（提供正常日攝入能量的~10%；0.01KJ/g 蛋白質/脂肪，1.47KJ/g 碳水化合物）。另一種FMD是供給3天飼喂，用于成年鼠神經生成評估，含有0.26KJ/g（0.01KJ/g蛋白質/脂肪，0.25KJ/g碳水化合物）。小鼠吃完了FND方案每天提供的食物，卻沒有表現出對食物有厭惡跡象。任何一種日糧飼喂期結束和在另一個FMD周期之前，供給小鼠自由采食TD.7912食物10天。在FMD之前，把小鼠轉換到新籠子里，以避免采食剩余的食物以及形成食糞癖。

生存分析

生存的終點，定義為處理開始日期和死亡日期之間的持續時間。小鼠出現嚴重應激、健康狀況惡化、腫瘤負荷過重，被認為瀕死，則處以安樂死。FMD組中有2只小鼠被廢棄，1只由于突發頭/頸損傷，另1只小鼠于麻醉期間死亡。包括在生存中共有75只小鼠，對照組46只，FMD組29只。12只小鼠由于進行性皮炎而廢棄（CTRL9只，FMD3只），在健康和壽命的評估中認定為死亡。2只被同類相食的小鼠，因為其在分析中，認定為是腫瘤以外的原因引起的死亡。二級分析認為2只鼠的死亡，與腫瘤產生的結果是相似的（數據未列出）。

生理標志物

采集測定血糖的血液之前，停止小鼠采食4小時，以免進食對血糖的干擾。使用精密的Xtra血糖監測系統（美國雅倍公司）測定小鼠的血糖。在增補的實驗程序中，全部使用一篇綜述介紹的商用試劑盒測出有關的結果。

全血細胞計數和細胞因子

全血細胞計數，使用深圳邁瑞公司獸用BC-2800血液分析儀，根據制造商的程序進行測定。簡言之，從尾靜脈把血液采進被肝素包被的微量血容管。20微升肝素化血液被加到臨床診斷溶液中稀釋，然后評估全血參數。細胞因子，用懸液芯片細胞因子測試儀（生物-拉德公司），遵循制造商推薦的方法進行血清分析。

超聲心動圖

小鼠用2%異氟烷麻醉，剃除左半側胸部體毛。把小鼠放置在加熱溫控墊上，連續地監測心率（400-500次/分）。使用超聲波傳輸膠（帕克實驗室），在胸骨旁短軸查看心臟的影像。在乳頭狀肌水平處，用高分辨率Vevo 770超聲系統（可視超聲公司），獲得2維B型影像，并用Vevo 770 2.2.3 軟件分析（可視超聲公司）。

X線計算機斷層掃描

把吸入性異氟烷放在小鼠（代表平均體重的）背部的一個固定位置，進行麻醉。由于延長了麻醉時間，麻醉室中只放3只小鼠，把老年小鼠意外死亡的風險降到最低。雙側股骨骨組織的礦物質密度（羥基磷灰石mg/cm3），使用西門子Inveon CT掃描儀測定，每組5只小鼠。增補實驗程序中，對此有詳細的描述。

骨髓采集和分析

骨髓細胞從alpha-MEM培養基（Corning Collgro公司）中的小鼠股骨和脛骨里收獲。采集的小鼠新鮮骨髓細胞用PBS洗滌后，根據制造商的指示，以特定譜系、Scal、C-試劑盒和溴脫氧尿苷抗體（BD生物科學公司）染色。使用BD FACS diva軟件在LSRⅡ流式細胞儀上進行分析。在人外周血液單核細胞亞群中的lin-CD184+CD45-間充質細胞/祖細胞，使用人造血譜系異硫氫酸熒光素混合物、抗人CD45 APC和抗人CD184-PE（eBioscience公司，#22-7778-72，#17-9459-42，#12-9999-42）進行鑒定。

免疫組強化學

為了檢測造血細胞的生成，在采集骨髓前24小時，把2%濾過無菌的溴脫氧尿苷（10㎎/ml原液，Sigma公司）按200㎎/㎏體重的一個單劑量注入小鼠腹腔。為了分析成年小鼠的神經生成，在FMD之前，按50㎎/㎏體重的劑量連續3或4天給小鼠注射溴脫氧尿苷（BrdU）。按照增補實驗程序中的描述，對BrdU、ki67蛋白、胚胎干細胞關鍵蛋白（Sox2）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、和雙腎上腺皮質激素進行染色。

免疫印跡

增補實驗程序中有詳細描述。

qPCR(定量聚合酶鏈反應)

相對轉錄水平，由定量實時PCR進行測定，這在增補實驗中有描述。

Y迷宮

每組11只小鼠在23月齡時進行測試。自發交替行為記分，被用于計算交替（單臂選擇不同于先前的雙臂選擇）對交替總數的比例。

加速旋轉

小鼠23月齡時，每組18只，使用加速旋轉法進行評估。記錄旋轉速度和旋轉后掉下來的時間。連續兩天，每天對小鼠進行3次連續試驗，兩天共試驗6次。用兩個變量測定小鼠耐受旋轉的性能：整個兩個連續試驗日中，個體最佳性能的平均，和在6次試驗中每個處理組小鼠保留平衡的平均時間，作為訓練指數。

新物體的識別

測試，由每個5分鐘的兩個試驗區組成。第一個試驗（T1）期間，測試裝置中含有兩個相同的物體。經過延遲1個小時的間隔后，進行第二個試驗（T2），把小鼠放回測試裝置，此時裝置中的兩個物體，一個是原來熟悉的，一個是新的。人工記錄T1和T2期間小鼠對每一個物體探索所化費的時間。以秒為單位記錄熟悉物體和新物體之間所化的探索時間，用來計算識別指數。

巴恩斯迷宮

每組12只23月齡小鼠，每天測試2次，共測試7天。成功率（100%，2分鐘內找到逃逸箱[EB]；0%，2分鐘內找不到EB），延遲（延遲進入EB），差錯的次數（向假洞偏頭和伸進鼻子），偏離（有多少首次偏離EB洞）和記錄所采取定位EB的策略，及從兩次測試得到測試的日平均值。搜索策略的分類，隨機（跨過迷宮中心），連續（順時針或逆時針方向搜索），或立體的（控制方向到達EB的差錯或偏差不超過3次記分）。第14天，評估一次保持記憶的情況。

酵母間歇性禁食

酵母細胞快速地從冰庫拿出放入YPD（酵母浸出粉胨葡萄糖培養基）盤，在30℃孵育2天。接著，把3-5個酵母菌落接種于2ml液態電解質中孵育過夜。把過夜的100ul培養液加入50ml長頸瓶的10ml新鮮電解質液中，30℃孵育3天。第3天，把稀釋的培養物涂布到YPD平板上，以評估活酵母細胞的數量。余下的培養物減慢轉速，移除培養基，顆粒用無菌蒸餾水洗滌2次之后，再懸浮于長頸瓶中的10ml無菌蒸餾水孵育2天。第5天，稀釋的培養物再涂布于YPD平板上，余下的培養物再成顆粒，懸浮于10ml無效培養基，孵育48小時。每2天重復交替地用蒸餾水和無效培養基處理，直到活酵母低于原初培養物的10%為止。

制備無效培養基，把3-5個菌落放5ml電解質液中過夜。500ul過夜的培養物加入500ml長頸瓶中的200ml SDC中，在定軌搖床中孵育4天。孵育期之后，培養物用0.22mm過濾器過濾，供實驗期中使用。

統計分析

所有的數據，均以平均數±標準誤表示。對小鼠的所有統計分析是雙面的，P值﹤0.05，差異是顯著的（﹡P﹤0.05,﹡﹡P﹤0.01,﹡﹡﹡P﹤0.001）。組間差異使用以下的方法進行測定，或者學生T檢驗比較，接著杜奇多重比較后進行單向方差分析，或者用GraphPad Prism V.5.軟件進行雙向方差分析（對于巴恩斯迷宮）。使用Gehan-Breslow-Wilcoxon 測試進行Kaplan-Meier生存曲線的比較。競爭風險分析被用來進行死亡率統計差異的評估。受試人，使用威爾森符號等級鑒定進行統計分析，其P值﹤0.05被認為顯著（﹡P﹤0.05，﹡﹡P﹤0.01，﹡﹡﹡P﹤0.001）。