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 摘要

延長禁食（PF）的時間，可提升抗應激的能力，但其對延長壽命的作用則知之甚少。我們研究表明，交替地PF和營養豐富的培養基延長了酵母的壽命，并確定這與延長壽命的基因無關。小鼠在一月中采食模擬禁食日糧（FMD）4天，把PF的副作用降到了最小，縮小了多個器官/系統的體積，恢復飼喂后，則提高了祖細胞和干細胞的數量及再生能力。經過兩個月的周期性FMD，延長了中年鼠的壽命，減少了內臟脂肪，降低了癌癥發病率和皮膚損害，延緩了骨礦物質密度的損失。周期性FMD對老年鼠的作用，促進了海馬的神經元再生，降低了類胰島素一號生長因子（IGF-1）和蛋白激酶A的活性，提升了神經源性分化因子1的水平，認知能力得到提高。于一個先導的臨床試驗中，經過3個FMD周期，減少了衰老、糖尿病、心血管疾病和癌癥的風險因子/生物標志物，卻沒有重大的副作用，為應用FMDs促進延年益壽提供了支持。

引言

膳食成分和能量水平，是影響衰老和與年齡相關疾病的關鍵因素(Antosh 等，2011；Blagosklonny 等， 2009；Fontana 等，2010；Gems 和 Partridge,，2013；López-Otín 等，2013；Tatar 等， 2003)。膳食限制（DR）促進代謝和細胞的變化，包括減輕氧化損害和炎癥，優化能量代謝和強化細胞保護(Haigis 等Yankner，2010；Johnson 等， 2000；Lee 等 2012b；Longo 和 Finch， 2003；Mair 和 Dillin， 2008；Narasimhan 等， 2009；Smith 等， 2008)。禁食是DR的極端形式，需要戒除所有的食物，但仍可以飲水，這一方法可以作為一種長期的方式應用，如間歇性禁食（IF），或周期性的持續2天或多天的長時間禁食（PF）(Longo 和 Mattson,，2014)。嚙齒動物應用IF，促進了糖尿病、心臟病和神經退變的保護性預防(Longo 和 Mattson，2014)。人類應用IF和較不劇烈的養生方案（例如，一周內安排2天，每天只消耗大約500千卡能量），對胰島素、血糖、C-反應蛋白和血壓產生了有益的影響(Harvie 等，2011)。

周期性持續2天或多天的PF，至少要間隔一個星期的正常飲食，正在成為一個保護正常細胞和器官免受毒素和有毒狀況危害的高度有效方法(Raffaghello 等 2008；Verweij 等，2011)，同時增加了多種類型癌細胞的死亡(Lee 等， 2012a；Shi 等， 2012)。PF引起了血糖、胰島素和IGF-1的下降(Lee 等，2010)，和伴有自體吞噬(Cuervo 等，2005；Madeo 等， 2010)。我們研究表明，隨著恢復喂食，PF引起的基于干細胞的免疫系統再生，引起了白細胞水平的較多下降（Cheng等，2014）。其他的作者，報告了PF在大鼠中所起的作用，引起了肝和體重的較多減少（Wasselin等，2014）。然而，長時間只供飲水的禁食，對絕大多數人是困難的，它的極端可能引發副作用，包括原先營養不良和機能障礙的進一步惡化，特別是那些年老和體衰的使用者。對這些問題應予重視，必要時進行飲食干預，既誘導得到PF樣作用，同時又把這些副作用和完全限食的風險降至最小。

這里，我們確定了一份模擬禁食日糧（FMD），模擬禁食對由PF引起的與抗應激相關標志物的影響，包括血糖和IGF-1的低水平，以及酮體和胰島素樣生長因子結合蛋白-1（IGFBP-1）的高水平（Longo 和Mattson，2014）。我們在小鼠中檢驗了持續4天FMD，然后仍以標準的自由飲食的周期性方案，可促進健康長壽的假設。此外，我們在一個由38個受試者其中19個分配為FMD組的先導隨機臨床研究中測試了三輪FMD的影響。

結果和討論

周期性禁食的啤酒酵母細胞延長了壽命，并誘生了抗應激性

為了確定周期性饑餓是否能使簡單生物得益，我們在啤酒酵母細胞（S.cerevisiae）中測試了周期性持續數天禁食（PF）的作用。我們使野型酵母細胞在營養豐富的培養基和水分之間于每48小時切換一次。使酵母細胞在生存期間，至少接受4輪PF。以此來輔助選出適于小鼠并能有效果的禁食持續時間。酵母細胞在二種培養物中周期地切換，延長了它們按時序排列的最長壽命，經過氧化氫處理的存活酵母細胞數量增加超過100倍（圖1）。令人驚訝的是，絲氨酸蘇氨酸激酶Rim 15或它的下游應激反應轉錄因子Msn2/4和Gis 1的缺失，對通過遺傳和膳食的干預達到好的結果，是重要和必要的（Fabrizio等，2001；Wei 等，2008），也不會妨礙PF對壽命的影響（圖1A和1B）。這些結果表明，PF可以保護簡單生物免于毒素和衰老機制的損害，這在一定程度上與保守的延壽轉錄因子無關，則與在線蟲（C.analogue）中的結果是一致的，完全禁食不需要應激反應轉錄因子DAF16，酵母Msn2/4和Gis 1類似物就能發揮作用（Gree 和 Brunet，2009；Kaeberlein等，2006）。

老年小鼠的周期性FMD

能量攝入總量沒有降低的周期性FMD促進了內臟脂肪的減少

我們開發了一個能量和蛋白質都非常低的禁食模擬日糧（FMD），它引起了與抗應激性或壽命相關的一些標志物含量的改變（IGF-1，IGFBP-1，酮體和血糖），這與禁食所引起的結果相類似（表S1）。小鼠在16月齡時開始實施每個月有兩次FMD，而在FMD之間則給予自由采食。對照飲食方案小鼠在21.5月齡時達到了最大體重（36.6±5.2g）,而FMD組小鼠在每個FMD周期時體重減輕多達～15%，不過，再給予飼喂后，大多數小鼠都恢復了體重（圖S1A）。不管怎樣，FMD組小鼠在16個月和22個月之間保持著恒定的體重，然后逐漸地減重（圖1D）。雖然，FMD小鼠在節食期間受到嚴重的能量攝入限制，但它們通過一段14天吃得很飽的自由采食所積累的能量，使能量的攝入得到了補償，相等于那些完全自由采食組小鼠所攝入的能量值（圖1E和S1B）。兩個組別的小鼠在25月齡后都增加了能量的平均攝入量（圖1E）。

FMD結束及恢復飼喂之前，小鼠的血糖水平，比那些對照的正常飼喂組小鼠降低40%。整個研究期中，血糖在恢復飼喂7天內仍返回到正常水平（圖S1C）。FMD結束時，酮體增加～９倍，但再飼喂后則恢復到正常水平（圖１Ｄ）。ＦＭＤ４天后，血清胰島素水平降低１０倍，再度飼喂后則恢復到基線水平（圖Ｓ１Ｅ）。生長激素／IGF-1軸信號的減少，表示嚙齒動物的健康和壽命得到了改善和延長（Brown Borg,2009；Guarente和Kenyon,2000；harrison等，2009；Junnia等，2013；Wullschleger等，2006）。IGF-1在FMD結束時降低了～45%，但即使經過多次FMD周期，均會恢復到原來的水平（圖S1F）。抑制IGF-1的IGFBP-1的含量，在FMD程序結束增加了8倍，但其血濃度在再度飼喂1周內，即可恢復到和那些一直自由采食小鼠相同的水平（圖S1G）。

為了研究節食誘導身體成分的改變，我們用微型CT評估了沉積體脂重量和去脂體重。28個月時的兩個FMD之間的自由采食期中測定，FMD組小鼠表明存在著總脂肪組織減少的趨勢（P=0.06）（圖1F）。雖然皮下脂肪體積（圖1G，1J和1K；灰色區域）不受影響，但內臟脂肪的沉積（圖1H，1J，和1K；紅色區域）FMD組與對照組相比有了減少（P﹤0.05）。兩組的去脂體重保持相同（圖1I）。這些表明，周期性FMD對內臟脂肪、血糖和IGF-1水平具有深刻的影響，但IGF-1水平的變化在自由采食時則可以逆轉。

器官再生和縮小

FMD（20.5月齡）、FMD-RF（FMD后恢復自由采食后7天）和自由采食（16和20.5月齡）小鼠實施安樂死，測定器官的重量。在FMD停止時，我們觀察到腎臟、心臟和肝等器官的重量減少（圖1L-1N），肺、脾和腦的重量沒有減少（圖S1L和S1M），以及體重降低（圖S1H-S1J）。這些器官的重量，在再度飼喂后恢復到FMD之前的水平。

雙周一次的周期性EMD的長期應用，沒有造成25日齡小鼠的收縮期和舒張期左心室容積、射血功能、左心室的重量和心臟功能出現差異（圖S1N-S1Q）。FMD停止時，肝萎縮的的標志物血清丙氨酸轉氨酶增加，但在再度飼喂后，則恢復到對照組水平（圖S1R）。隨著再度飼喂，肝細胞重新在肝血管附近聚集（圖1 O4，箭頭）。FMD對肝再生的作用，由恢復飼喂后24小時時，引起了肝細胞增殖標志物Ki67 10倍量的產生得到證實，但在細胞G 0期該標志物則不存在于細胞中（圖1P的S1S）。Ki67的水平在FMD后至少維持3天的升高。腎功能，通過血清肌酐和血尿素氮的測定來評估（圖S1T和S1V）（Schnell等，2002）。腎小球和間質纖維化的組織學評估，顯示硬化腎小球數量也沒有變化（圖S1V）。這些資料證實，由于FMD后再飼喂周期的結果，引起了肝臟的再生，即使在FMD4個月以后，肝或腎也沒有出現毒副反應。

骨髂肌出生后的生長和再生，需要稱為衛星細胞的肌原性前體細胞才能進行（Sinha等，2014）。Pax7的表達，對衛星細胞的發生、存活和自我更新，是至關重要的（Olguin等，2007），而肌源性轉錄因子MyoD和MyoG促進肌肉的發育和分化（Perry和Rudnick，2000）。在未分化的肌源性細胞中觀察到了Pax7上調和降低MyoD的表達（Olguin等，2007）。Pax7(圖1Q)和MyoD(MyoG較不明顯)年齡相關的下降于20月齡的小鼠中檢測到（圖S1W和S1X）。FMD停止時，與對照組比較，Pax7的表達降低～40%。也在MyoG中觀察到類似的趨勢（P=0.074）。恢復飼喂后1周，在20月齡FMD組小鼠中Pax7的表達達到類似于12月齡自由采食小鼠的水平（圖1Q）。相比之下，MyoD在老年鼠中的表達沒有受到FMD的影響（圖S1W和S1X）。總之，這些變化是與再度飼喂時的肌肉再生和復壯相一致的，盡管進一步分析類似進行的造血和神經系統活動，對證實這個假設和確定它的機制原由是必要的。不同時間的異種共生，也表明了老年肝細胞的增殖指數和老年肌肉衛星細胞的增殖和再生能力提升，以及促進成年小鼠中與年齡相關方式的神經再生（Conboy和Rando,2012；Villeda等2011）。有關肌肉和大腦再生的一些蛋白質中的一種生長分化因子-11（GDF-11），可能促成多個系統的再生作用（Katsimpardi等，2014；Sinha等，2014）。這對確定FMD復壯作用，是否部分地可能涉及一些因子包括或與GDF-11有關。

未能誘導自噬，會導致細胞損傷、癌變和衰老（Cuervo等，2005）。自噬可通過間接測定自噬封存（LC3）和降解（P62）來進行監測（Moscat和Diaz Meco，2011）（圖S1Y和S1Z）。P62水平，在自噬缺陷細胞中一直是升高的（Komatsu等，2007）。觀察到自由采食的20月齡小鼠肌肉中的P62，是伴隨著年齡的增加而升高，但FMD組則不是這樣的（圖1R），這表明FMD可能與再生保護肌肉細胞免于年齡相關性功能下降，包括維持自噬蛋白的正常表達能力有關。

雙側股骨組織中礦物質中密度，28月齡C57BL/6小鼠與12月齡小鼠的相比降低（圖1S），這與先前發表的數據是相一致的（Shen等，2011）。28月齡時股骨的骨密度，FMD組較高于對照日糧組（圖1S），周期性FMD或減少了年齡相關性骨礦質密度或誘導了骨的再生。

癌癥和炎癥

C57BL/6小鼠，易于患造血組織的腫瘤和惡性淋巴瘤（Blackwell等，1995）。衰老小鼠的皮下和體內，常有腫瘤或膿腫兩者引起的團塊（圖2A-2H和S2A-S2D）。FMD組與對照組相比，表明腫瘤發病率降低45%（圖2I）。到達生命終點，對照組小鼠淋巴瘤的發病率～67%，而FMD組小鼠則只有～40%（圖2J），并沒有引起腫瘤類型的改變。值得注意的是，FMD還推遲了與腫瘤相關的死亡三個多月，對照組的死亡時間為25.3±0.66個月，而FMD組則為28.8±0.72個月（P=0.003）（圖2K）。此外，尸體剖檢顯示，對照組小鼠有多個（3個或更多）異常病變，高于FMD組小鼠3倍以上（P=0.0067；費歇爾確切概率法）（圖2L）。因此，在中年開始周期性FMD，降低了腫瘤發病率，延緩了腫瘤的發生，并使病變數量大幅度地減少，FMD一般地可能影響惡性的腫瘤向良性轉變。

炎癥，在包括癌癥的許多與年齡相關疾病的發生中，有著關鍵的作用（Bertke等，2013和Morgen等，2007）。病理學分析顯示，FMD組小鼠比對照組小鼠減少了炎癥組織的數量（例如，炎性反應淋巴結或慢性肝臟炎癥，表S2）（圖2M）。在C57BL/6小鼠中，觀察到的炎性疾病之一，是嚴重的潰瘍性皮炎（圖2N）。由于進行性皮膚病損而必須的廢棄率，在對照組小鼠為～20%，而FMD組小鼠則只有～10%（Coppé 等，2010)。

FMD對免疫衰老和骨髓衍生的干細胞及祖細胞的影響

年齡相關的由造血作用下降引起的適應性免疫細胞產生減少或變異的現象，稱為“免疫衰老”，表現為淋巴樣細胞與髓樣細胞的比例轉換以及貧血和髓系惡性腫瘤的發病率上升（圖2O-2S）（Muller-Sieburg等，2004和Shaw等，2010）。全血計數表明，FMD使血象更具活力（圖2Q-2S；圖S2E-S2R；表S3），與年齡相關的淋巴細胞對髓樣細胞的比例（L/M）（圖2P）、年齡相關性血小板和血紅蛋白的減少得到了逆轉（圖2Q-2S）。同樣，周期性FMD 4個月，導致了紅細胞計數和血紅蛋白較基線水平有了提高（圖2Q-2S）。我們還測定了一組23個細胞因子，FMD組除了IL-12和RANTES（調節活化正常T細胞表達和分泌蛋白）升高，以及GM-CSF（粒細胞巨噬細胞剌激因子）減少以外，均未檢測到改變（圖S2S-S2U）。這些結果表明，FMD的長期使用，促進了免疫系統的再生和復壯，這與我們先前關于禁食對淋巴細胞數量影響的研究結果，是相一致的（Cheng等，2014）。

其中的骨髓衍生干細胞、造血干細胞和間充質干細胞，是作為一個成年組織和器官再生的潛在資源。為了研究FMD的復壯作用，是否可能與干細胞有關，我們測定了骨髓中造血的（HSPC，lin-Scal-1+C-kit+CD45+）和間充質的（MSPC，lin-Scal-1+CD45-）干細胞及祖細胞的數量。已知HSPCs的數量是隨著年齡而增加的，這可能是為了補償功能的下降（Geiger和Van zant，2002；Morrison等，1996）。年齡相關性增加可能會掩蓋禁食或FMD促進干細胞自我更新的作用，這一點我們最近在較年青小鼠研究中已有發現（圖S2V）（cheng等，2014）。不同于HSPCs，MSPCs的數量則隨著年齡增長而下降（Bellantuono等，2009；Kasper等，2009）。我們證實，成年（8-10月齡）和20.5月齡小鼠中的MSPC的比較數量，隨著年齡增長而而減少（圖2T），這與以前的報告是一致的（Kasper等，2009；Ratajczak等，2008）。而FMD組小鼠的MSPCs的數量增加到5倍（469.8±179.5FMD對95.5±16.7對照組；圖2T和2W），FMD處理組小鼠的BrdU+MSPCs增加到45倍（69.8±34.0FMD對1.5±0.6對照組）（圖2T和S2X）。總之，這些數據表明，周期性FMD在促進造血的和間充質的干細胞及祖細胞的增加方面是有效的，這可能會有助于各種類型細胞/系統的再生。